有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是进化上保守的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr) 蛋白激酶，它在所有真核生物细胞中传递着多种细胞外信号从而决定细胞行为和细胞命运。这些激酶作为磷酸化介导信号传导的主要调节者已在各种生理过程中得到了广泛研究。细胞外信号调节激酶ERK(包括结构和功能高度相似的异构体ERK1 和ERK2)是首先被鉴定出来的MAPK，并且是Ras GTPases的主要效应因子，而Ras-ERK信号是调控哺乳动物细胞正常分裂或细胞癌变的关键通路之一。Ras-ERK通路的失调会导致各种遗传性和获得性人类疾病。特别是，由于上游信号分子的频繁突变或过度表达，使得ERK1/2的高度激活在人类肿瘤中很普遍。针对这条信号通路所开发的小分子抑制剂是迄今为止靶向癌症治疗最成功的例子之一。例如，特异靶向BRAF V600E的抑制剂已被FDA批准用于治疗不可切除或转移性黑色素瘤，而BRAF V600E这种突变在约 50%的人类黑色素瘤中被发现。然而，这些疗法仅作用于由致癌基因BRAF驱动的肿瘤，对Ras突变导致的肿瘤作用有限。此外，这些疗法的效果都比较短暂，这是因为肿瘤几乎无法避免地会对这些疗法产生耐药性，而最常见的耐药原因是ERK1/2的重新激活。

尽管认识到ERK1/2在各种生理和病理过程中发挥的关键作用，但是关于ERK激活的调控机制仍然不是完全清楚。唯一已知的主要机制是上游激酶MEK对ERK1/2的磷酸化。目前尚不清楚是否有任何其它蛋白质翻译后修饰也有助于ERK（或其它 MAPK）的激活。此外，MAPK级联激活已经进化出高度特异性，每个级联仅对一组独特的细胞外刺激有响应。细胞信号在每个级联间如何有效且精确地地传输尚不十分明确。尽管已经提出支架蛋白可以将MAPK级联的组分聚集在一起，但几种潜在的支架蛋白的作用，包括参与ERK级联激活的支架蛋白，其功能仍有待确定。

在此项工作中，作者先发现ERK1/2被Lys63连接的多聚泛素化修饰，并证明这种非典型泛素化与ERK1/2激活相关。作者鉴定到三基序蛋白TRIM15为ERK1/2的主要泛素连接酶，并确认其对Lys63连接的多泛素化的特异性。通过数据分析和生化实验， 作者进一步证明了肿瘤抑制因子CYLD是ERK1/2的Lys63连接泛素化的特异去泛素化酶 (DUB)。作者通过大量的实验明确了TRIM15和CYLD与ERK1/2的物理和功能上的相互作用。通过质谱和定点突变，他们确定了ERK1/2发生泛素化的特定赖氨酸残基。通过改变TRIM15和CYLD的表达水平以及利用泛素化位点的突变，作者证明了Lys63连接的多泛素化在ERK1/2的激活中起着关键作用。机制上，Lys63多泛素化促进了ERK与MEK的相互作用从而激活。

此外，作者还表明下调TRIM15的表达会抑制黑色素瘤以及其他肿瘤的生长。重要的是，敲低TRIM15还可以有效杀死对BRAF V600E抑制剂耐药的肿瘤细胞。通过分析肿瘤样本和公共数据库，他们发现TRIM15的上调和CYLD的下调都与黑色素瘤患者的转移和较差的存活率有关。

总之，研究人员发现了一种以前未被认识的机制，该机制控制着ERK（以及可能的其它MAPK）的激活。它们表明泛素化和磷酸化之间存在一种新的相互调节，可确保 MAPK 级联内信号转导的效率和特异性。这些发现还揭示了TRIM15和CYLD是影响包括耐药性黑色素瘤在内的许多肿瘤增殖的关键因素，因此可能最终有助于开发更有效的抗癌疗法。

宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院杨小鲁教授为本篇论文的通讯作者，博士后朱贵欣为第一作者。此外，来自费城The Wistar Institute的Meenhard Herlyn教授也为此研究提供了帮助。

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自动感应给药

类风湿性关节炎 (rheumatoid arthritis，RA) 是一种累及周围关节为主的慢性、对称性、进行性自身免疫炎症性疾病，流行病学调查显示，全世界 0.5%～1% 的人口患有 RA，我国的发病率约为 0.42%。

随着治疗水平的进步，越来越多的 RA 治疗药物出现，主要包括非甾体类抗炎药 (NSAIDs)、改善病情抗风湿药物 (DMARDs)、糖皮质激素以及生物制剂等。尽管这些药物在抗炎、延缓疾病进展等方面有一定效果，但其不良反应依旧是一个不可忽视的问题。

文章中提到，治疗 RA 的生物药物通常旨在靶向多种炎性细胞因子和通路，包括白细胞介素 - 1 (IL-1)、IL-6 和肿瘤坏死因子 -α (TNF-α)。但大约 40% 的患者对药物治疗没有反应 ，药物还会抑制患者免疫系统，增加感染风险。

Guilak 说：“医生经常通过注射或输注抗炎生物药物来治疗类风湿性关节炎患者，但这些药物给药时间长、剂量高，在产生有益作用的同时会引起严重的副作用。一些研究已经发现， IL-1 受体拮抗剂（IL-1Ra）能够减少 RA 关节损伤，但由于其半衰期短，未能成为治疗 RA 的常规药物。”

同时，不同的给药途径也会带来相应问题，如糖皮质激素长期口服可能带来如感染、癌症风险上升等不良反应；但频繁采取局部给药 (关节腔内注射) 则会出现持续性疼痛等问题。因此，如何提高 RA 药物治疗的效果以及减少其不良反应已经成为研究热点。

而 Guilak 团队则利用合成生物学手段，在诱导多能干细胞 (iPSC) 中设计了一个基因线路（如下图），当白细胞介素 - 1 与细胞膜上的 IL-1 受体结合，就会通过 NF-κB 信号通路，激活趋化因子 Ccl2 启动子，启动下游 IL-1Ra 基因，分泌 IL-1Ra 并释放到细胞外与 IL-1 竞争性结合 IL-1 受体，最终减少细胞免疫反应。

在细胞植入阶段，为了更好的让细胞定植，该团队开发了一种 3D 编织支架，植入软骨细胞形成仿真的软骨组织，最终再将工程细胞接种到这一组织中。植入动物体内后，细胞可以存活数月或更长时间，持续发挥治疗作用。

“这些被编程的细胞可在皮下或关节中停留数月，当它们感觉到炎症刺激时，就释放生物药物。”Guilak 说。

文章表示，植入的工程细胞可以在体内炎症发作时被激活，解决了注射 IL-1Ra 的方法在体内半衰期短的问题，可作为一种长期药物递送方法，具有重要的临床研究价值。

可应用于多种慢性病

研究的实验对象选用了炎症性关节炎小鼠小鼠模型，植入了工程细胞复合物后，小鼠的炎症指标降低了约 40%，同时炎症因子对骨的侵蚀也有所减少。

研究人员还发现，工程细胞单次被激活所释放的 IL-1Ra 至少能持续 72 小时，而一些研究已经报道的注射型 IL-1Ra 仅能持续数小时。研究人员猜测，这是由于细胞内 IL-1Ra 是通过转录翻译生成的，是一个可持续过程，而外源的 IL-1Ra 更多是一种即用型蛋白药物。

文章指出，这项研究的一个不足之处是只做了 40 天的研究，没有进行更长时间的研究。其团队正在寻找能够以更高的密度和更长期存活率封装细胞的生物材料，并计划继续试验 CRISPR-Cas9 和干细胞，制造一种能够响应不同炎症触发因素，并释放出对应生物药物的工程细胞。

“干细胞的优势就是能够灵活分化成各种类型的细胞，并可以根据已知的药物靶点，设计基因线路，合成能够治疗各类慢性疾病的细胞。”Guilak 说。

合成生物学的基因线路的一大优势是工程化和模块化，此前华东师范大学叶海峰教授在接受生辉 SynBio 的采访时，也提出了类似的概念 ——“智能药物工厂”，通过人工基因线路的设计与编程指导底盘细胞输出多种多样的蛋白药物分子，例如：酶、抗体、激素等，通过不同的指令可以控制细胞释放多种药物进行联合治疗。

越来越多细胞疗法的研究开始开发能够感知和动态响应疾病标记的基因线路，提供可精确控制、长期递送药物的系统，基于工程细胞的疗法能否成为医学的下一个前沿？

原文链接：

https://www.genengnews.com/news/crispr-engineered-cells-release-drug-in-response-to-inflammation-when-implanted-into-mice/

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abj1414

具体来讲，在实施放疗/化疗后，她们用三维电子显微镜首先观察到TAMM（肿瘤相关单核细胞和巨噬细胞）被诱导后迁移到相对静止的肿瘤干细胞微环境。她们进一步用生物信息学分析方法分析了在实施放疗/化疗后不同时间点收集的单细胞RNA 测序数据，发现细胞毒性 CD8 +T 细胞经过放疗/化疗诱导激活的 FASL-TNFRSF1 信号具诱导肿瘤干细胞凋亡的潜能。有趣的是面对该威胁，肿瘤干细胞释放出平时存在于细胞内的核糖体蛋白S19（RPS19）， 后者通过结合位于肿瘤相关单核细胞和巨噬细胞膜（TAMM）表面的C5AR1受体产生免疫抑制信号【3】。肿瘤干细胞还通过释放释放巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）来激活广泛表达于肿瘤微环境的 CD74， 后者也产生免疫抑制信号【4】。RPS9-C5AR 和 MIF-CD74介导的免疫抑制信号包括TGFβ， IL-10， PD-L1， 等一些列分子，解释了为什么在临床上单独阻断TGFβ， IL-10，或 PD-L1往往在不同癌症治疗中得到不一致的疗效。与其它类型的微环境细胞相比，TAMM 在形成针对 CD8 +T 细胞的免疫抑制屏障方面发挥了主要作用，这与 她们观察到的TAMM在应对放化疗的初始增加和 T 细胞的减少一致。

进一步，她们使用腺瘤-类器官与TAMM共培养、TAMM细胞耗竭和体内谱系追踪来证明 PGE2依赖性信号传导的功能作用。应对放化疗，TAMM被诱导到肿瘤干细胞微环境还通过前列腺素E2的信号作用于其表达在肿瘤干细胞表面的受体EP4。这PGE2-EP4信号通路又通过 AKT 磷酸化增强 了β-Catenin【1】活性以促进生存下来的肿瘤干细胞的增殖。这是癌症复发的一个重要机制。

这项工作揭示了肿瘤干细胞和其微环境之间的双向信号通导，为理解肿瘤微环境尤其是TAMM 在保护 TSC/CSC 免受细胞毒性 CD8+T 细胞以及支持 TSC/CSC 增殖方面的作用阐述了分子机理和确定了潜在的治疗靶点。该团队正在使用肠癌患者来源的异种移植 (PDX) 动物模型来验证这些发现。这将可能发展出克服免疫抑制屏障的新方法用以在临床上增加结肠癌及其它癌症对免疫治疗的反应。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109674

参考文献：

1. He, X., Yin, T., Grindley, J.C., Tian, Q., Sato, T., Tao, W.A., Dirisina, R., Porter-Westpfahl, K.S., Hembree, M., Johnson, T., et al. (2007). PTEN-deficient intestinal stem cells initiate intestinal polyposis. Nature genetics 39, 189-198.

2. He, X., Chen, S.,  et al., Cell Reports (2021). Tumor Initiating Stem Cell Shapes Its Microenvironment into an Immunosuppressive Barrier and Pro-tumorigenic Niche(https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109674).

3. Markiewski, M.M., Vadrevu, S.K., Sharma, S.K., Chintala, N.K., Ghouse, S., Cho, J.H., Fairlie, D.P., Paterson, Y., Astrinidis, A., and Karbowniczek, M. (2017). The Ribosomal Protein S19 Suppresses Antitumor Immune Responses via the Complement C5a Receptor 1. J Immunol 198, 2989-2999.

4. Figueiredo, C.R., Azevedo, R.A., Mousdell, S., Resende-Lara, P.T., Ireland, L., Santos, A., Girola, N., Cunha, R., Schmid, M.C., Polonelli, L., et al. (2018). Blockade of MIF-CD74 Signalling on Macrophages and Dendritic Cells Restores the Antitumour Immune Response Against Metastatic Melanoma. Frontiers in immunology 9, 1132.

在细菌和古细菌宿主与感染它们的病毒之间的永久冲突中，CRISPR-Cas 系统通过程序化的免疫记忆提供了一种适应性防御机制。这些系统在参与这些过程的不同域和核糖核蛋白中显示出显著的变化。Class 1 CRISPR 系统具有由多个 Cas 蛋白组成的效应复合物，而 Class 2 系统依赖于介导 crRNA 结合和干扰的单效应器、多域蛋白。

在已知系统中，只有 type III 和 type VI 系统针对 RNA。在类型 III 系统中，RNA 靶向由Cas7 介导，通过RRM 结构域中的酸性残基催化向导：靶标双链体的切割。VI 型系统包含单蛋白 CRISPR 效应器 Cas13，它通过其两个 HEPN 结构域的基本残基进行 RNA 干扰，并且当被目标识别触发时，会进行不加选择的附带 RNA 切割 。Cas13 已被用于基于 CRISPR 的核酸检测分析 和一套 RNA 靶向技术。然而，Cas13 的附带活性会导致多种哺乳动物细胞类型的细胞毒性，这凸显了对更好工具的需求。

该研究表明亚型 III-E 效应子 Cas7-11 是Class 1 CRISPR-Cas 系统中的单蛋白效应子，源自推定的 Cas11 结构域和衍生自亚型 III-D 的多个 Cas7 亚基的融合。来自 Desulfonema ishimotonii Cas7-11 (DiCas7-11) 的在大肠杆菌中表达时，对 mRNA 和噬菌体具有显著的 RNA 干扰效果。

与许多 Class 2 效应子类似——并且在 Class 1 系统中是独一无二的——DiCas7-11 将 pre-CRISPR RNA 加工成成熟的 CRISPR RNA (crRNA) 并在靶标：间隔双链体定义的位置切割 RNA，没有可检测的非特异性活性。该研究设计了 Cas7-11，用于哺乳动物细胞中的 RNA 敲低和编辑。该研究表明 Cas7-11 对细胞活力没有影响，而其他 RNA 靶向工具（如短发夹 RNA 和 Cas13）显示出大量的细胞毒性。这项研究说明了从多亚基Class 1 效应器复合物进化出单蛋白效应器，扩大了对 CRISPR 系统多样性的理解。Cas7-11 为新的可编程 RNA 靶向工具提供了基础，这些工具没有附带活动和细胞毒性。

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