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国家药监局药审中心关于公开征求《慢性丙型病毒性肝炎直接抗病毒药物临床试验技术指导原则(征求意见稿)》意见的通知
通知原文:https://www.cde.org.cn/main/news/viewInfoCommon/a55d4bd9891e2ae7c7598fbd65c73d11
02
国家药监局药审中心关于发布《注意缺陷多动障碍(ADHD)药物临床试验技术指导原则(试行)》的通告(2021年第37号)
通知原文:https://www.cde.org.cn/main/news/viewInfoCommon/2b0f84e0627bf8d61470246373c36c70
03
国家药监局药审中心关于发布《儿童用化学药品改良型新药临床试验技术指导原则(试行)》的通告(2021年第38号)
通知原文:https://www.cde.org.cn/main/news/viewInfoCommon/924cbea7b9ce702f48196eb8f80d5479
01
诺和诺德口服PCSK9抑制剂获批临床
CDE最新公示,诺和诺德公司(Novo Nordisk)申报的1类新药NNC0385-0434片,已获得临床试验默示许可,拟开发用于:在杂合子型家族性高胆固醇血症、确诊心血管疾病或心血管高风险的成人患者中降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的治疗,单独用药或与他汀类药物联合使用。公开资料显示,这是一款靶向PCSK9的口服制剂,目前正在全球开展2期临床试验。
02
海创药业治疗消化道肿瘤CD44v6抑制剂在中国申报临床获受理
近日,海创药业宣布,公司从德国amcure GmbH公司引进的一款潜在“first-in-class”在研新药——HP558注射液的临床试验申请已经获得中国国家药监局(NMPA)的正式受理。HP558是一款特异性靶向CD44v6的抑制剂,已在欧洲完成临床1期试验。值得一提的是,目前全球尚无报道同适应症的同靶点药物进入临床试验。
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治疗急性髓系白血病,CRISPR编辑干细胞疗法获FDA快速通道资格
9月9日,Vor Biopharma宣布,美国FDA已授予其工程化造血干细胞(eHSC)候选药物VOR33快速通道资格,用于治疗急性髓系白血病(AML)。
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君实生物提交Claudin18.2单抗临床申请
9月10日,君实生物公告宣布提交的JS012注射液临床试验申请获得药监局受理,用于治疗晚期恶性肿瘤,例如胃癌及胰腺癌等。
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靶向CD4,传奇生物CAR-T疗法在美国启动临床试验
9月13日,传奇生物(Legend Biotech)公司宣布,基于美国FDA批准的IND申请,将开始在研细胞疗法LB1901的1期临床试验,用于治疗成人复发/难治性外周T细胞淋巴瘤(PTCL),或皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。LB1901是一款在研自体CD4靶向嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法,可与CD4特异性结合。CD4是一种在大多数T细胞淋巴瘤(TCL)亚型中表达的膜糖蛋白。
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恒瑞1类新药SHR7280获批临床,防止提前排卵
近日,CDE官网显示,恒瑞的SHR7280片临床试验申请获得药监局的批准,辅助生殖技术中,用于控制性超促排卵治疗的患者,防止提前排卵。
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百济神州「替雷利珠单抗」美国上市申请获FDA受理,治疗食管鳞状细胞癌
9月13日,百济神州宣布,美国食品药品监督管理局(FDA)已受理其抗PD-1抗体药物百泽安®(替雷利珠单抗注射液)的新药上市申请(BLA),用于治疗既往经系统治疗后不可切除、复发性局部晚期或转移性食管鳞状细胞癌(ESCC)患者。根据《处方药使用者付费法案》(PDUFA),FDA对百泽安®上市申请做出决议的目标日期为2022年7月12日。这是百泽安®在中国境外的首项药政申报,此前在国内已有五项适应症获批。
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国产第 3 家,海正药业「门冬胰岛素注射液」获批上市
9月13日,海正药业发布公告,该公司门冬胰岛素注射液已获得国家药监局批准上市,用于治疗糖尿病。
09
翰森制药:全球首创抗真菌新药在中国挺进III期临床
9月13日,翰森制药宣布已向中国国家药品监督管理局(NMPA)递交ibrexafungerp的III期临床试验申请,用于治疗霉菌性阴道炎(VVC)。
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安科生物生长激素获批新适应症,治疗特发性矮小
9月13日,中国国家药监局(NMPA)公示,安科生物新增申报的注射用重组人生长激素用于治疗特发性矮小(ISS)适应症的上市许可申请,已正式获批。此前,该上市申请曾以符合儿童生理特征的儿童用药品新品种、剂型和规格,被中国国家药品监督管理局药品审评中心(CDE)纳入优先审评程序。
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信达生物2款双特异性抗体获批临床
9月14日,中国国家药监局药品审评中心(CDE)最新公示,信达生物申报的两款1类生物新药均已获批临床,分别是CD3/Claudin 18.2双特异性抗体IBI389,及CD47/PD-L1双特异性抗体IBI322。其中,IBI389为首次在中国获批临床。
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2小时内无痛患者翻倍,口服多机制偏头痛疗法有望明年获批
9月14日,Axsome Therapeutics公司宣布,美国FDA已接受具有多重作用机制的复方偏头痛疗法AXS-07的新药申请(NDA),用于急性治疗偏头痛,PDUFA目标日期定为2022年4月30日。
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麓鹏制药新一代BCL-2抑制剂LP-118完成首例患者给药
9月14日,广州麓鹏制药有限公司宣布其在研新药LP-118的临床I期研究(CTR20211648)完成首例患者给药(First-in-Human Dose)。该研究由广东省人民医院吴一龙教授牵头,旨在评估LP-118对晚期恶性肿瘤患者的安全性/耐受性、探索最大耐受剂量(MTD)和剂量限制性毒性(DLTs),人体药代动力学(PK)特征以及确定后期临床研究推荐剂量,并同时评估其初步疗效。
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基石药业PD-L1/4-1BB/HSA三抗临床获批,治疗晚期实体瘤
9月15日,基石药业宣布,多特异性抗体CS2006(NM21-1480)在中国的临床试验申请(IND)获国家药监局的批准。该产品极具同类最优免疫治疗骨架分子的潜力,有望成为肿瘤免疫治疗领域极有前景的下一代PD-1/PD-L1治疗方法。
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首款IL-5单抗!葛兰素史克「美泊利单抗」即将在华获批
9月15日,葛兰素史克在中国提交的美泊利单抗注射液上市申请(受理号:JXSS2000021)已进入“行政审批”阶段,将于近期获国家药监局批准上市,将会是国内首个批准上市的IL-5单抗。
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恒瑞「吡咯替尼」新适应症上市申请获受理
9月15日,CDE官网显示,恒瑞的马来酸吡咯替尼片新适应症上市申请(受理号:CXHS2101041)获受理,据推测适应症应是早期或局部晚期HER2阳性乳腺癌新辅助治疗。
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百济神州BTK抑制剂斩获FDA第三项适应症
9月15日,百济神州宣布,美国FDA已加速批准其布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂百悦泽(泽布替尼),用于治疗接受过至少一种抗CD20抗体治疗的复发/难治性(R/R)边缘区淋巴瘤(MZL)成年患者。新闻稿指出,这是百悦泽在FDA获得的第三项批准,也是其首次在边缘区淋巴瘤领域获批。
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旨在功能性治愈HIV感染,CRISPR基因编辑疗法即将启动1期临床试验
9月15日,Excision BioTherapeutics公司宣布,美国FDA已经接受了EBT-101的IND申请。EBT-101是一种以CRISPR为基础的候选疗法,旨在功能性治愈慢性1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)感染。本次IND许可使Excision能够启动EBT-101的首次人体1/2期临床试验,以评估EBT-101在HIV-1感染者中的安全性、耐受性和疗效。
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治疗非小细胞肺癌,武田“first-in-class”精准疗法获FDA加速批准
9月16日,武田(Takeda)公司宣布,美国FDA已加速批准其口服酪氨酸激酶抑制剂Exkivity(mobocertinib)上市,用于治疗携带EGFR外显子20插入突变的局部晚期或转移性非小细胞肺癌(NSCLC)患者。他们在接受含铂化疗治疗中或治疗后疾病出现进展。新闻稿指出,这是美国FDA批准的首款专门为携带EGFR外显子20插入突变的NSCLC患者设计的口服疗法。
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三迭纪第3款3D打印药物向FDA递交申请
近日,三迭纪自主研发的第三个药物产品T21,正式向美国FDA递交PIND会议申请。目前,全球共有四个进入或完成注册申报的3D打印药物产品,三迭纪贡献了其中三个,并刷新了新兴技术产品的开发速度。
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复宏汉霖PD1单抗新适应症上市申请获受理
9月16日,CDE官网显示,复宏汉霖斯鲁利单抗(HLX10)注射液上市申请获受理。据推测,适应症是sqNSCLC。复宏汉霖在2021年中期业绩报告中提到,斯鲁利单抗联合化疗一线治疗局部晚期或转移性鳞状非小细胞肺癌(sqNSCLC)的全球多中心III期临床试验已完成受试者招募入组,计划于2021年下半年就该适应症向NMPA递交NDA。
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CD20/CD3双抗获批临床,诺诚健华和康诺亚生物合作开发
9月16日,诺诚健华和康诺亚生物联合宣布,已经收到中国国家药品监督管理局(NMPA)核准签发的《药物临床试验批准通知书》,同意双方合资公司天诺健成研发的CD20 x CD3双特异性抗体CM355开展CD20+B细胞血液瘤的临床试验。
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诺奖得主联合创建,Intellia公司CRISPR基因编辑TCR-T疗法步入临床
9月16日,由诺奖得主Jennifer Doudna教授联合创建的Intellia Therapeutics公司宣布,美国FDA已接受其CRISPR基因编辑改造的TCR-T细胞疗法NTLA-5001的IND申请,该公司将启动临床试验治疗急性髓系白血病(AML)。
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针对80%-90%实体瘤!重磅TCR-T疗法获批临床
近日,专注于开发实体瘤TCR-T疗法的T-Cure Bioscience宣布,美国FDA已批准其TCR-T候选产品的研究性新药(IND)申请。T-Cure公司将启动针对表达KK-LC-1抗原的肿瘤(如胃癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌和其他KK-LC-1阳性上皮癌)的1期临床研究(NCT05035407)。
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恒瑞SHR-1701临床获批,联合伊立替康脂质体二线治疗食管鳞癌
9月17日,CDE官网显示,恒瑞SHR-1701注射液新适应症临床实验申请获得药监局批准,联合伊立替康脂质体用于经PD-1/PD-L1单抗联合含铂化疗一线治疗失败的局部晚期或转移性食管鳞癌患者。
治疗糖尿病严重并发症,细胞疗法3期临床试验获积极中期结果
近日,Ixaka公司宣布,其在研的自体多细胞疗法(MCT)REX-001在一项3期临床试验中获得积极中期结果。该试验评估了EX-001相比安慰剂,治疗患有慢性肢体威胁缺血(CLTI)的糖尿病患者的安全性和有效性。在对中期疗效和安全性数据进行评估后,独立数据监查委员会(DMC)建议按计划继续试验,获益/风险比可接受,且无显著安全性问题。
治疗年龄相关性黄斑变性,C3补体抑制剂3期临床结果发布
9月9日,Apellis公司公布了靶向补体C3蛋白的在研疗法pegcetacoplan,在两项3期临床试验DERBY和OAKS中获得的顶线结果。两项试验在1258例年龄相关性黄斑变性(AMD)的地图样萎缩(GA)成人患者中,通过往眼球玻璃体内注射pegcetacoplan,评估其疗效和安全性。根据获得的结果,Apellis计划在2022年上半年向美国FDA提交pegcetacoplan治疗GA的新药申请(NDA)。新闻稿指出,如果获批,pegcetacoplan将成为治疗GA的首款疗法。
获FDA快速通道资格,创新吸入式抗生素疗法达到3期临床终点
日前,Zambon公司宣布,使用其I-neb适应性吸入式气溶胶给药系统递送粘菌甲酸钠(CMS),在非囊性纤维化支气管扩张(NCFB)患者中进行的3期临床试验PROMIS-I中达到主要终点。相比安慰剂, CMS I-neb组NCFB患者疾病急性加重的年发生率显著减少(0.58比0.95,RR: 0.61,95% CI 0.46-0.82,p=0.00101)。
88%客观缓解率,双特异性抗体初步临床结果发布
近日,Genmab和艾伯维(AbbVie)公司宣布,其在研CD3/D20双特异性抗体epcoritamab的1/2期临床试验EPCORE NHL-1结果, 在著名学术期刊《柳叶刀》杂志上发布。该试验评估了该疗法在复发/难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)患者中的安全性与疗效。
一线治疗胃食管腺癌,HER2靶向双特异性抗体达到90.9%疾病控制率
9月13日,Zymeworks公司宣布,其在研靶向HER2的双特异性抗体疗法zanidatamab,在一线治疗表达HER2的胃食管腺癌(GEA)患者的临床试验中获得积极结果。截至2021年3月18日,在可以评估的22名患者中,zanidatamab与标准化疗联用,达到68.2%的确认客观缓解率。这一试验的最新结果将在9月16日的ESMO大会上公布。
NASH创新疗法最新2期结果公布,显著降低纤维化生物标志物水平
9月13日,Hepion Pharmaceuticals公司公布了在研新型亲环素(cyclophilins)抑制剂CRV431的2a期临床试验AMBITION的额外疗效数据。数据显示,接受CRV431治疗患者的生物标志物水平变化与CRV431的抗纤维化作用一致。该公司计划很快启动2b期临床试验ASCEND-NASH。
疾病控制率达100%!友芝友生物公布EpCAM/CD3双抗1期临床数据
9月13日,友芝友生物宣布,该公司将于2021欧洲肿瘤内科学会(ESMO)年会上公布其自主研发的注射用重组抗EpCAM和CD3双特异性抗体药物(代号:M701)针对恶性腹水患者进行的1期临床试验中期研究成果。研究显示,M701单药治疗展现出了良好的腹水控制效果,并表现出了良好的安全性和耐受性。
近1/4患者生存时间超过3年,BMS双免疫疗法长期临床结果积极
9月13日,百时美施贵宝(Bristol Myers Squibb)公布了3期临床试验CheckMate-743的三年随访数据。试验数据表明,其抗PD-1抑制剂纳武利尤单抗,联合CTLA-4抑制剂伊匹木单抗构成的双重免疫疗法,与含铂标准化疗相比,一线治疗不可切除的恶性胸膜间皮瘤(MPM)患者可获得持久的生存获益(无论肿瘤组织学特征如何)。
多种实体瘤中显示抗癌活性,TCR-T细胞疗法初步临床结果积极
9月13日,Adaptimmune Therapeutics宣布了其靶向MAGE-A4的T细胞抗原受体细胞疗法(TCR-T)ADP-A2M4CD8,在多种实体瘤中开展的1期临床试验SURPASS的最新数据。
一线治疗胃癌,百济神州PD-1抗体组合疗法达到68.2%缓解率
日前,Leap Therapeutics公司宣布,该公司开发的潜在“first-in-class”抗体疗法DKN-01,与百济神州开发的抗PD-1抗体替雷利珠单抗(tislelizumab),以及化疗联用,在一线治疗晚期胃癌和胃食道结合部(GEJ)癌患者的2a期临床试验DisTinGuish中获得积极初步结果。在接受了一个完整DKN-01疗程的患者中,客观缓解率(ORR)达到68.2%,其中携带DKK1高表达肿瘤的患者的ORR达到90%。
显著减轻疼痛并改善功能,骨关节炎创新疗法3期临床结果积极
9月15日,Ampio Pharmaceuticals公司宣布,在研疗法Ampion在3期临床试验AP-013中获得积极顶线结果。该试验评估了关节内(IA)注射Ampion,对膝关节严重骨关节炎(OAK)成人患者的疗效。试验结果表明,在治疗12周时,Ampion使严重OAK患者的疼痛具有统计学显著性地减轻,并表现出显著的功能改善。Ampio计划与美国FDA讨论3期临床结果和生物制品许可申请(BLA)。
First in class干眼症疗法 IIb 期研究成功,显著改善症状及体征
9月15日,Aerie Pharmaceuticals宣布TRPM8受体激动剂AR-15512滴眼液治疗干眼症的IIb期COMET-1研究获得积极结果。AR-15512对眼部多种症状和体征有统计学意义改善。Aerie表示接下来将进行另外两项为期3个月的III期疗效研究和一项额外的安全性研究。
first in class选择性SIRPα抑制剂 I期结果积极
9月16日,OSE公司和勃林格殷格翰(BI)共同公布了first in class选择性SIRPα抑制剂BI 765063联合PD-1单抗BI 754091 (ezabenlimab) 治疗晚期实体瘤患者 I 期剂量递增积极数据。
缓解率高于单药治疗17.3%!安进KRAS抑制剂联合疗法数据公布
9月16日,安进公布了针对KRAS G12C突变晚期结直肠癌 (CRC) 患者的Ib/II期CodeBreaK 101研究的首个联合疗法积极结果。新的数据显示,KRAS G12C抑制剂Lumakras(sotorasib)与安进抗EGFR单抗Vectibix(panitumumab)联用具有令人鼓舞的疗效和安全性。支持开展Lumakras联合Vectibix三线治疗CRC的III期研究。
多种实体瘤中显示抗癌活性,TCR-T细胞疗法初步临床结果积极
9月16日,Carrick Therapeutics在2021 ESMO大会上公布了first in class口服CDK7抑制剂samuraciclib (CT-7001)令人鼓舞的初步临床数据。
01
Nature | 江浩团队揭示H3K27去甲基酶UTX通过相分离发挥抑癌作用的新机理
2021年9月15日,弗吉尼亚大学江浩团队在Nature杂志上发表文章UTX condensation underlies its tumour-suppressive activity,揭示了UTX 通过相分离这一生物物理属性凝聚MLL4和P300来实现对增强子处的表观遗传修饰(H3K4Me,H3K27Ac)以及染色质三维结构的改变(chromatin looping),从而调控基因表达,发挥其抑癌和维持正常发育的作用。并且,UTY凝聚体固化的物理属性导致其抑癌作用不及UTX。
更多解读:
研究人员发现UTX蛋白质序列中含有一段内在无序区(IDR),而高频出现的UTX突变体在该序列之前就已终止,这提示该IDR对于UTX的功能可能具有特殊的意义。体外表达纯化蛋白UTX-IDR以及细胞内外源表达ΔIDR突变体等实验表明该IDR可以介导UTX通过液液相分离形成蛋白质凝聚体(biocondensates)。功能试验表明, ΔIDR突变体不再抑制THP-1,Miapaca等癌细胞的生长和致癌性。通过对IDR中特殊氨基酸组成的改变以及互补嵌合型突变体的研究,研究人员进一步建立了UTX相分离与其发挥抑癌作用的正相关性。同时,研究人员通过CRISPR技术构建了UTX-ΔIDR小鼠胚胎干细胞系。超高分辨率显微成像显示,内源UTX以颗粒形式存在于细胞核中,并且在荧光漂白后能快速恢复,这与蛋白质凝聚体的特质十分符合。ΔIDR突变体的颗粒度明显下降,并且影响胚胎干细胞向中胚层分化,说明UTX相分离也调控着干细胞分化。
通过光控(Opto-genetics)、细胞内共表达以及纯化蛋白等实验,研究人员发现UTX结合蛋白MLL4和P300可以和UTX共存于同一蛋白凝聚体之中。而当IDR缺失后这些现象大大减弱。体外组蛋白甲基化实验表明,缺失IDR或者结合结构域TPR会显著降低核提取物的MLL3/4生化活性—H3K4单甲基转运,而互补嵌合型突变体则具有和完整UTX相当的能力。同样,IDR和TPR结构域对于UTX在细胞内发挥H3K27去甲基化的功能也十分重要。
基因组水平上的测序分析发现,UTX和MLL4/P300形成的共聚体改变了THP-1细胞中染色质的表观遗传修饰。ΔIDR影响了染色质上UTX结合处的H3K4Me1和H3K27Ac信号改变,这两者都是活跃增强子的标识。基于活化启动子和增强子的HiChIP分析发现,UTX的表达改变了染色质环化(chromatin looping), 而这些变化有赖于IDR介导的相分离。这些looping增强处所激活的基因主要是应急和免疫反应相关基因,looping减弱处所抑制的基因和核糖体形成以及细胞分裂相关。这进一步解释了UTX凝聚体抑制肿瘤的分子机理。
有趣的是 ,基于UTY不同的IDR氨基酸序列构成,UTY的相分离能力比UTX更强, 形成的凝聚体更少液态性(表现在UTY的光漂白恢复能力以及扩散系数都要低于UTX)。功能实验表明UTY以及UTY嵌合UTX突变体的抑癌能力也要低于UTX, 而这可能因为UTY凝聚体内的分子运动和碰撞受限制。这一发现再次支持了江浩团队去年在Nature Cell Biology发表的论文观点(详见BioArt报道:NCB | 江浩团队揭示AKAP95可通过相分离调控基因剪接和肿瘤生成) --- 一些基因调控蛋白不仅需要相分离形成凝聚体, 还需要合适的凝聚体生物物理属性才有好的活性来调控基因表达以及癌症。
值得一提的是,在同期还有篇来自剑桥大学David Lara-Astiaso和Brian J. P. Huntly的News & Views文章Protein condensation enables chromatin control,对该篇文章进行了点评。
石碧、李薇、宋艳苏、王振佳博士为共同第一作者。加州大学尔湾分校的Michelle A. Digman和Enrico Gratton课题组 以及弗吉尼亚大学臧充之课题组(含王振佳博士)参与了本文章的合作。
原文链接:
https://www.nature.com/articles/s41586-021-03903-702
Nat Commun | 余健秀/程金科/陈国强团队揭示低氧促进AGO2线性泛素化修饰调控肿瘤发生发展新机制
2021年9月13日,上海交通大学医学院余健秀/程金科/陈国强团队在Nature Communications 杂志上在线发表了题为“Hypoxia regulates overall mRNA homeostasis by inducing Met1-linked linear ubiquitination of AGO2 in cancer cells”的研究论文,该研究首次发现低氧诱导的AGO2蛋白M1型线性泛素化修饰能够调控整体mRNA稳态平衡,从新的角度揭示了肿瘤细胞低氧适应的分子机理。
miRNA是一类广泛存在于真核生物中,长度约19~25 nt、序列保守的非编码单链小分子RNA,在转录后水平介导靶标mRNA降解或翻译抑制。据保守估计,miRNA可直接调控超过50%的蛋白编码基因,参与近乎所有已知的细胞生命活动,形成了巨大的调控网络。因此,深入研究miRNA介导的基因沉默及其调节机制具有重要意义。
虽然不同的miRNA独立表达,有各自的转录调节机制,但是转录生成后所有前体miRNA都需经过一条共同的加工装配途径才能够发挥功能,该途径异常将最大程度上破坏miRNA调控网络。余健秀团队长期研究工作发现该途径中核心蛋白的翻译后修饰对miRNAs通路起着重要调节作用Nature communications(2021;2015)、Molecular cancer(2017)和Nucleic acid research(2015;2018;2021)。AGO2蛋白作为miRNA通路的核心效应分子,不仅对miRNAs功能的发挥起着决定性作用,对维持整个miRNAs调控网络的稳定性至关重要。因此,AGO2蛋白功能调节机制尤为重要,如AGO2乙酰化修饰(Oncogene 2019) 和AGO2磷酸化修饰 (Neoplasia2020)等。
在此项工作中,作者首先通过RIP-seq/RNA-seq/miRNA-seq检测发现:低氧条件下,miRNA通路抑制,其靶标mRNA降解阻滞,进而呈现整体性累积。采用定量质谱分析表明:低氧能够促进miRNA通路核心效应分子AGO2蛋白与线性泛素化链组装复合物(linearubiquitin chain assembly complex, LUBAC)相互作用。LUBAC是目前发现的唯一一个介导线性泛素链合成的E3泛素连接酶。体内和体外的生化实验均证实LUBAC能够催化AGO2蛋白发生Met1型连接的线性泛素化修饰(Met1-linkedlinear polybiquitination,M1-Ubi),且该修饰具有动态可调控性,低氧信号对其具有诱导作用。结合高通量测序结果并进一步实验证实:低氧诱导的AGO2蛋白M1-linear-ub修饰能够阻碍AGO2/miRNAs与靶标mRNA结合,抑制了miRNA介导的基因沉默效应,导致靶标mRNA降解阻滞进而整体性累积。最后,通过美国癌症基因图谱计划(TheCancer Genome Atlas , TCGA)数据库中大样本肺癌测序数据分析发现:在肿瘤组织中随着低氧程度升高,miRNA靶标mRNA水平整体性升高,两者之间存在显著的正相关性。提示在低氧环境下,miRNAs介导的基因沉默途径抑制,导致靶标mRNA整体性累积,由于大量靶基因水平失调,稳态破坏,最终可能引发细胞恶变、肿瘤发生等。这一发现挑战了传统观点认为低氧主要调控miRNA表达或加工生成,提出了低氧调控miRNAs活性的新机制。
综上,该研究首次提出肿瘤低氧微环境调控mRNA稳态平衡的观点,并从新的角度揭示了低氧对miRNAs调控网络的动态调节机制,为肿瘤研究提供了新思路。此外,到目前为止,关于线性泛素化修饰的研究报道主要是在NF-kB等炎症和免疫相关信号通路中。该研究鉴定了AGO2蛋白为线性泛素化新底物,首次证实M1-linear-ub修饰也可发生于miRNA途径中,预示着其具有更广泛的生物学意义,也将进一步拓展M1-linear-ub修饰的研究到新领域。
上海交通大学医学院生物化学与细胞分子生物系张海龙博士后、赵娴副研究员和郭岩珉博士后为论文共同第一作者,余健秀研究员、程金科教授和陈国强院士为该论文共同通讯作者。该研究工作获得了国家自然科学基金重点项目、国家自然科学基金创新研究群体项目、科技部国家重点研发计划项目、上海市自然科学基金原创探索项目等资助。
原文链接:
https://www.nature.com/articles/s41467-021-25739-5
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STTT | 刘青松/王文超/刘静发现FLT3-ITD 阳性急性髓系白血病的新的潜在治疗策略
2021年9月15日,中国科学院合肥物质科学研究院刘青松,王文超及刘静共同通讯在Signal Transduction and Targeted Therapy(IF=18.19)在线发表题为“Targeting chaperon protein HSP70 as a novel therapeutic strategy for FLT3-ITD-positive acute myeloid leukemia”的研究论文,该研究发现了一种具有强大抗肿瘤功效的新型 HSP70 抑制剂,并表明靶向 HSP70 可能是治疗 FLT3-ITD 阳性 AML 的一种有前景的治疗方法,具有克服耐药性的潜力。
更多解读:
大约 25% 的急性髓性白血病 (AML) 携带 FLT3-ITD(内部串联重复)致癌突变。虽然 FLT3 激酶抑制剂已成功应用于临床治疗 FLT3-ITD 阳性 AML,但在长期治疗后观察到获得性耐药。因此,对于 FLT3-ITD 阳性 AML,寻求新的治疗策略仍然势在必行。
在针对 AML 的激酶抑制剂研究期间,研究人员发现 BTK 抑制剂 QL-XII-47(QL47)对携带 FLT3-ITD 突变的 AML 细胞系(MOLM13/MOLM14/MV-4-11)表现出有效的抗增殖活性,而其他两种 BTK 抑制剂没有明显影响。此外,BTK 敲低对 MOLM13 增殖没有影响。此外,激酶分析证实 QL47 不结合 FLT3-WT 或 FLT3-ITD2。因此,排除了 QL47 通过 BTK 或 FLT3 介导其抑制活性的可能性。
出乎意料的是,该研究观察到 QL47 处理导致 MV-4-11/MOLM13 细胞中 FLT3-ITD 蛋白以时间和剂量依赖性方式减少,并抑制 FLT3-STAT5-MYC 信号通路激活。使用实时 RT-PCR,该研究首先排除了 QL47 通过转录调节影响 FLT3 的可能性。然后该研究检查了 QL47 在蛋白质合成抑制剂放线菌酮 (CHX) 和蛋白酶体抑制剂 MG132 存在下的作用。结果表明,QL47 与 CHX 的组合比单独的 CHX 诱导 FLT3-ITD 蛋白的减少更快,MG132 增强了这种作用。这些结果表明 QL47 除了翻译抑制外,还通过蛋白酶体途径诱导 FLT3-ITD 蛋白降解。
热休克蛋白 (HSP) 在蛋白质稳态和折叠中发挥重要作用,特别是对于癌症中过度表达或突变的癌蛋白。因此,该研究使用生物素化的 QL47 衍生物 47biotin 研究了 QL47 和 HSP 之间可能的相互作用。该研究意外地发现,即使在严格的高盐条件下,HSP70 而不是 HSP90 也以竞争性方式与链霉亲和素琼脂糖一起沉淀,这表明 QL47 和 HSP70 可能存在共价相互作用。
然后,该研究通过质谱分析验证了 HSP70 和 QL47 之间的结合,发现 HSP70 中的 TAC267ER 肽在与 QL47 相互作用时被修饰,证实了 HSP70 和 QL47 之间的共价键。为了进一步确认 QL47 的结合位点,将截短的蛋白质,即 HSP70 核苷酸结合域(NBD;aa 1-382)和底物结合域(SBD;aa 383-642)转染到 HEK293T 细胞中并用47biotin 沉淀,结果显示NBD而不是SBD保留了与47biotin 的相互作用,表明QL47确实靶向NBD处的HSP70蛋白。
ATPase 和蛋白质重折叠试验表明,与经典的 ATP 竞争性 HSP70 抑制剂 VER155008 相比,QL47 具有独特的作用模式。QL47 通过 HSP70 抑制荧光素酶重折叠,但对 HSP70 的 ATPase 活性没有影响。一致地,计算机辅助结构分析显示 QL47 在 ATP 结合口袋附近的大凹槽中与 HSP70 结合,而不占据 ATP 结合位点。
作为伴侣蛋白,HSP70 通过多种存活途径维持癌细胞的存活。然而,尚未报道 HSP70 对 FLT3-ITD 的影响。为了证实 HSP70 在 FLT3-ITD 阳性 AML 中的作用,该研究首先通过免疫共沉淀验证了 HSP70 和 FLT3 蛋白之间的相互作用,结果显示内源性 HSP70 与在 HEK293T 细胞中过表达的 FLT3-ITD 蛋白一起沉淀。
该研究接下来检查了 QL47 在 FLT3-ITD 阳性患者来源细胞中的抗白血病功效,发现 QL47 抑制了这些细胞的增殖。此外,在耐midostaurin MV-4-11 细胞(具有N676D 突变)中,QL47 显示出比midostaurin 更强的抗增殖活性,诱导细胞凋亡,并减少FLT3-ITD-N676D/MYC 蛋白。此外,QL47 使 MV-4-11-MR 细胞对midostaurin 敏感六倍。最后,在 MV-4-11 细胞驱动的小鼠骨髓移植模型中评估了 QL47 的抗肿瘤功效,QL47 不仅显著延长了动物的存活率,而且显著减少了骨髓中 MV-4-11 细胞的数量。
总之,该研究发现了一种具有强大抗肿瘤功效的新型 HSP70 抑制剂,并表明靶向 HSP70 可能是治疗 FLT3-ITD 阳性 AML 的一种有前景的治疗方法,具有克服耐药性的潜力。由于 QL47 也被报道通过翻译起始抑制具有抗病毒作用,因此需要进一步研究以确定 QL47 的抗肿瘤活性是否由 HSP70 和翻译的双重抑制引起。
原文链接:
https://www.nature.com/articles/s41392-021-00672-704
STTT | 中南大学陆前进等团队发现系统性红斑狼疮的潜在治疗靶点
2021年9月14日,中南大学陆前进及Wu Haijing共同通讯在Signal Transduction and Targeted Therapy(IF=18.19)在线发表题为“AIM2 deficiency in B cells ameliorates systemic lupus erythematosus by regulating Blimp-1–Bcl-6 axis-mediated B-cell differentiation”的研究论文,该研究报告了 AIM2 在人类扁桃体记忆和生发中心 (GC) B 细胞以及来自狼疮患者循环和皮肤病变的记忆 B 细胞和浆细胞中的表达增加。
黑色素瘤中缺失 2 (AIM2) 最初被确定为黑色素瘤的肿瘤抑制因子, AIM2 是干扰素 (IFN) 诱导型 PYHIN 蛋白家族的成员。在免疫细胞中,AIM2 主要在先天免疫中观察到,如巨噬细胞和树突状细胞,其功能是感知病原体相关或宿主来源的胞质 dsDNA,招募其他炎性体成分,如 ASC 和 pro-caspase-1,并诱导依赖于 caspase 的炎性体形成。AIM2-炎症小体可以进一步促进 IL-18 和 IL-1β 的产生或 gasdermin-D (GSDMD) 介导的细胞焦亡。此外,AIM2 的炎症小体独立功能也与调节有关。然而,AIM2 是否对免疫细胞,尤其是适应性免疫细胞发挥非炎症小体依赖性作用,尚不清楚。
系统性红斑狼疮 (SLE) 是一种自身免疫性疾病,其特征是产生大量自身抗体。因此,作为抗体的主要来源的 B 细胞被认为是导致 SLE 中观察到的免疫异常的主要免疫细胞。在外周循环中,成熟的 B 细胞被自身或外来抗原激活,然后分化为记忆 B 细胞或产生抗体的浆细胞。在生发中心 (GC) 反应之后,B 细胞最终分化为浆细胞。虽然记忆 B 细胞不能分泌抗体,但它们可以进一步经历体细胞超突变 (SHM) 和/或类别转换,然后在随后的抗原暴露后分化为浆细胞。这个过程主要由 B 调节淋巴细胞诱导成熟蛋白 1 (Blimp-1)-Bcl-6轴调节。
Blimp-1(由 Prdm1 编码)控制浆细胞的分化。Bcl-6 被充分证明是 GC B 细胞分化的关键转录因子。在分化之前,Blimp-1 被 Bcl-6 抑制。据报道,Prdm1 的表达增加可能是由于 Bcl-6 结合组蛋白去乙酰酶 (HDAC) 的释放,从而增加了 Prdm1启动子区的组蛋白乙酰化水平。Blimp-1 抑制 Bcl6、Pax5 和 Spib 的基因转录,它们反过来抑制 Blimp-1 转录以及 GC B 和浆细胞分化。因此,Bcl-6-Blimp-1 轴控制 B 细胞分化。
在这里,该研究首先描述了人类扁桃体记忆和 GC B 细胞以及来自狼疮患者外周血的记忆 B 细胞和浆细胞中 AIM2 水平的增加。为了进一步探索 AIM2 在 B 细胞中的功能,该研究构建了 CD19 条件敲除 AIM2 小鼠。B 细胞中 AIM2 的缺失减少了 KLH 诱导的抗体产生并改善了狼疮症状。在机制上,发现 IL-10 通过 DNA 去甲基化上调 AIM2 表达,发现 AIM2 直接与 Blimp-1 和 Bcl-6 结合,并调节它们的表达。该研究的发现可能为狼疮治疗提供一个新的靶点。
原文链接:
https://www.nature.com/articles/s41392-021-00725-x
05
J Hepatol (IF=25) | 杨鹏远/王福生发现肝细胞癌免疫治疗的新的潜在靶标
2021年9月12日,中国科学院生物物理研究所杨鹏远及中国人民解放军总医院王福生共同通讯在Journal of Hepatology (IF=25.08)在线发表题为“Intratumoral stem-like CCR4+ regulatory T cells orchestrate the immunosuppressive microenvironment in HCC associated with hepatitis B”的研究论文,该研究通过流式细胞术在鼠模型和临床样品中分析 CCR4+ Treg。该研究发现CCR4+ Treg 是乙型肝炎相关 HCC (HBV+ HCC) 中募集的主要 Treg 类型,与索拉非尼耐药性和 HBV 载量滴度相关。肿瘤内干细胞样 CCR4+ Treg 协调了肿瘤微环境 (TME) 中免疫抑制的资源细胞。
肝细胞癌 (HCC) 约占原发性肝癌的 90%,是全球第四大流行癌症。在北美和欧洲,HCC 主要由丙型肝炎病毒感染、饮酒或非酒精性脂肪性肝病发展而来;然而,在东亚和非洲,乙型肝炎病毒 (HBV) 感染是主要的病因。HBV 感染是 HCC 发展的主要危险因素,通常伴随长期慢性炎症。HCC 的发病率随着病毒载量和感染持续时间的增加而增加,表明这种慢性炎症状态导致肿瘤发生的风险不断增加。然而,将炎症发病机制与致癌作用联系起来的机制,以及其在诱导肿瘤微环境 (TME) 中的持续作用,在很大程度上仍然未知。确定 HCC 的发病机制可能会促进肝癌治疗的进展。
表达 CD25 和FoxP3 的调节性 T 细胞 (Tregs) 被认为在免疫监视过程中起负面作用,导致肿瘤耐受。HBV 感染尤其促进了大量 Tregs 的募集和积累。TME 会阻碍有效的抗肿瘤反应并导致不良预后。然而,这些肿瘤浸润性 Tregs (TIL-Tregs) 尚未得到很好的表征。最近的一项研究证明了 Tregs 的巨大异质性,揭示了在调节免疫反应和肿瘤进展中的多种重要作用。然而,哪些 Treg 亚群介导了免疫抑制的细胞资源以及 Treg 库如何在长期炎症性 TME 中维持很大程度上未知。
CC 趋化因子受体 4 (CCR4) 在 Treg 和其他 T 辅助细胞 (Th) 上表达,与其配体 CCL22 和 CCL17 结合,并且是介导 Treg 进入 TME 的关键趋化因子受体。TGF-β 信号升高优先诱导 CCL22 的高产生,从而通过其受体 CCR4 募集 Treg 以促进免疫逃逸并促进 HBV+HCC 的静脉转移。此外,目前批准用于晚期 HCC 的一线全身治疗索拉非尼可诱导 CCL22 上调通过 TNF-α/RIP1/NF-κB 信号通路,导致HBV+HCC 的耐药性。因此,CCR4 响应肿瘤衍生的趋化因子 CCL22,可能是 Treg 积累及其随后促进HCC 中的免疫抑制性 TME。
在这里,该研究证明 CCR4+ Treg 是在 HBV+HCC TME 中鉴定的主要 Treg 子集。在功能上,CCR4+Tregs比CCR4-Tregs具有更强的免疫抑制作用,其特点是具有PD-1+ TCF1+干细胞样特性,在HBV+HCC中介导免疫抑制和免疫逃逸的细胞资源。因此,靶向 CCR4 的免疫疗法可能是补充 HCC 一线/二线治疗药物的潜在策略,通过特异性阻止 Tregs 募集到 TME 并抑制 TIL-Tregs 的维持以启动 T 细胞再激活和抗肿瘤免疫。
原文链接:
https://www.journal-of-hepatology.eu/article/S0168-8278(21)02027-4/fulltext#%2006
CMI | 中国农业大学于舒洋课题组揭示RNA结合蛋白SRSF1调控iNKT细胞发育分化和功能的重要机制
中国农业大学的于舒洋课题组于2021年9月14日在Cellular & Molecular Immunology杂志上发表了题为“SRSF1 plays a critical role in invariant natural killer T cell development and function”的研究论文,该研究揭示了RNA结合蛋白SRSF1(Serine/Arginine Splicing Factor 1)在iNKT细胞发育分化以及功能的重要作用和相关机制,为iNKT细胞发育转录后水平调控机制的解析提供了新的视角,为iNKT细胞的临床应用提供了新的理论基础和靶位点。
SRSF1作为一个重要的剪切因子,在pre-mRNA的剪切、mRNA稳定性及转录延伸等重要生物学过程中发挥着重要功能,但是其在iNKT细胞发育过程中的生物学功能尚不清楚。该研究利用T细胞特异性缺失SRSF1的小鼠,系统的分析了SRSF1对iNKT细胞发育、分化以及功能的调控作用,通过一系列的实验证实SRSF1可以内源性的调控iNKT的早期发育以及iNKT2的分化。SRSF1缺失后iNKT细胞的增殖减少,凋亡增加,同时其前体DP细胞的TCRα重排和凋亡异常,最终导致iNKT细胞IL-4的分泌能力降低;对急性肝损伤的耐受力增强,肝损伤程度减弱,证实SRSF1不仅可以调控iNKT细胞的发育分化,在其功能等方面也具有至关重要的作用。同时该研究也为SRSF1和iNKT细胞相关的肝脏疾病的预防与治疗提供了新的思路。
机制分析发现,SRSF1缺失后一系列的基因表达出现紊乱。其中重要的转录因子Myb的可变剪切出现异常,通过一系列的体内体外实验共同证实,SRSF1可以通过调控Myb的可变剪切,维持在免疫细胞中发挥重要功能的短亚型Mybp75的丰度,进一步利用骨髓嵌合小鼠模型证实过表达Mybp75能部分回补SRSF1缺失所造成的缺陷。综上,该研究系统的阐明了RNA结合蛋白SRSF1在iNKT细胞发育分化和功能中的重要调控,建立了SRSF1与急性肝损伤之间的联系,完善了iNKT细胞的转录后调控网络,对肝脏相关疾病的预防与治疗提供了新的思路与理论基础。
中国农业大学生物学院于舒洋教授为该论文的通讯作者,中国农业大学生物学院博士研究生刘晶晶和游孟昊为该论文的共同第一作者,中国科学院生物物理所的薛愿超研究员在机制方面提供了宝贵的指导与建议。
原文链接:
https://www.nature.com/articles/s41423-021-00766-w
07
Sci Adv | 唐力团队用化学方法实现免疫调节蛋白在肿瘤组织中的特异性激活
瑞士洛桑联邦理工学院 (EPFL) 的唐力课题组设计了新型的 “开关式免疫调节蛋白 (Switchable Immune Modulator,Sw-IM) ”方案。这一方案利用肿瘤微环境中高还原性和弱酸性等特殊的生理条件,通过含双硫键、马来酰亚胺等环境响应性化学键的连接结构将PEG等具有良好生物相容性的亲水聚合物修饰到免疫调节蛋白表面的氨基上以封闭其生物活性。体内给药时,Sw-IM的生物活性在血液循环和健康组织中保持“关闭”状态,从而极大地降低了免疫治疗的系统毒性。当Sw-IM随血液循环进入肿瘤组织后,肿瘤微环境的特异性刺激可以通过高效地切断连接结构中的环境响应性化学键移除作为屏蔽的聚合物,从而在肿瘤组织中特异性地“开启”免疫调节蛋白的生物活性。这项成果于9月11日在Science Advances发表,题为:Switchable immune modulator for tumor-specific activation of anticancer immunity。
Sw-IM技术被首先应用于协同刺激抗体anti-4-1BB。与普通的anti-4-1BB抗体相比,具有氧化还原响应性的“开关式”anti-4-1BB抗体 (Swredoxa4-1BB) 在保持了抗肿瘤免疫效果的同时,可有效避免过度激活脾脏和肝脏中等健康组织中的CD8+ T细胞及其引起的毒性和组织损伤。由于氨基普遍大量存在于蛋白表面,Sw-IM技术也广泛适用于包括anti-PD-1、anti-CTLA-4免疫检查点阻断剂和IL-2、IL-15在内的细胞因子等免疫调节蛋白药物。
在临床治疗中,免疫调节蛋白常与过继T细胞疗法 (Adoptive T cell transfer, ACT) 联用以增强后者对固体肿瘤的治疗效果。然而在这类联合治疗中,由免疫细胞在健康组织中大量扩增引发的系统毒性通常更加严重。唐力课题组使用“开关式”IL-15细胞因子超级激动剂 (SwredoxIL15) 与过继T细胞的联用,不仅能达到普通IL-15超级激动剂与过继T细胞联用时的抗肿瘤效果,同时有效避免了CD8+ T细胞和NK细胞在健康组织中的激活和扩增, 显著降低了血清中丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 和门冬氨酸转移酶 (AST) 等肝脏损伤指标,显示出Sw-IM技术的巨大应用潜力。
得益于环境响应性化学的丰富性,Sw-IM的设计具有高度的模块化特性。除了适用于各种免疫调节蛋白之外,还可以通过选用不同的环境响应性化学连接结构使Sw-IM适应多样化的肿瘤微环境。在本工作中,通过精密设计的“自分解 (self-immolative) 结构,Sw-IM可以实现对免疫调节蛋白的”“无痕释放 (traceless release) ”。另一方面,通过改变屏蔽聚合物的种类、分子量和修饰密度,可以设计调节Sw-IM对肿瘤微环境中特定刺激的敏感度,从而进一步平衡并优化Sw-IM的安全性和抗肿瘤活性。在本工作的最后,该团队通过对不同的屏蔽聚合物分子量和修饰密度的筛选,发现并报道了Sw-IM设计的一般规律。
该研究以化学方法为基础,为提高协同刺激免疫蛋白的治疗安全性开拓了新的思路,也为其投入临床应用提供了更多的可行性。本工作第一作者为唐力课题组赵宇博士,通讯作者为唐力教授。
原文链接:
http://doi.org/10.1126/sciadv.abg729108
Nat Commun | 李蔚/史偈君联合开发计算衡量DNA甲基化/去甲基化拮抗作用的方法
近日,来自美国加州大学尔湾分校李蔚教授团队的史偈君等研究人员在Nature Communications杂志发表文章The concurrence of DNA methylation and demethylation is associated with transcription regulation,开发了基于亚硫酸氢盐测序(bisulfite-seq)的计算生物学方法——甲基化并发率 (methylation concurrence ratio),能够衡量甲基化和去甲基化过程在基因调控元件上的拮抗作用,具有不同于传统平均甲基化 (average methylation ratio) 的生物学特性,并可作为抑癌基因的新型表观遗传分子标记。
更多解读:
自甲基化测序方法面世以来,DNA 甲基化水平一直以“平均”的方式进行量化,但这种方法无法刻画甲基化的局部变异。如图1a所示,虽然两个例子的甲基化模式存在明显差异,但平均甲基化却都是0.5。Example 2中存在较多的不完全甲基化片段,在这些片段上可能同时存在甲基化与去甲基化作用。因此,研究人员将不完全甲基化片段中的未甲基化CpG定义为“甲基化并发CpG”(图1b中红色所示),甲基化并发率即为并发CpG的比率。如图1b所示,与平均甲基化相比,甲基化并发率对甲基化模式的局部变异更加敏感。研究人员分析了DNMT 和 TET 酶的ChIP-seq数据,并定义了基因启动子区的“DNMT-TET共结合指数”。该指标越大,表明DNMT 和 TET 酶在启动子区的共结合效应越强;反之,若该指标为0,则表明两者不存在共结合。该共结合指数与甲基化并发率之间存在显著的正相关性(Spearman’s r = 0.47,图1d),而与平均甲基化的相关性并不显著(图1c)。这表明甲基化并发率可以刻画DNMT 和 TET 酶的共结合,而平均甲基化则不能。
虽然平均甲基化方法已被广泛使用,但其与基因表达的关系仍不完全明确。目前普遍认为启动子区CpG岛(CpG island)的平均甲基化与基因表达水平呈负相关,但是基因体区域(gene-body)和增强子区域(enhancer)的平均甲基化与基因表达的关系仍存在争议。本研究发现,不同类型调控元件的平均甲基化与基因表达水平的相关性不尽相同。而甲基化并发率能够更好的指示基因表达水平,不论哪一种基因调控元件(例如启动子、基因体和增强子)上的甲基化并发率始终与基因表达呈现较强的负相关性。之后,研究人员发现抑癌基因在正常样本中的甲基化并发率水平很低,并且该现象在不同组织中高度保守。通过分析TCGA中多种癌症(子宫肌瘤、乳腺癌等)样本的甲基化组,进而发现肿瘤中甲基化并发率的升高与 40~60% 的抑癌基因表达下调有关,而这些基因的平均甲基化却未发生改变。总之,本研究提出了甲基化并发率这一新型甲基化量度方法,强调了甲基化局部变化对基因表达的显著影响,拓展了我们对肿瘤异常甲基化模式的理解。
文章的第一作者为史偈君博士,通讯作者为李蔚教授。
原文链接:
https://www.nature.com/articles/s41467-021-25521-709
Cell | 基因治疗新突破——AAV衣壳变异体实现肌肉组织定向基因转导
2021年9月9日,来自美国布罗德研究所的Pardis C. Sabeti团队与哈佛大学的Amy J. Wagers团队合作,在Cell杂志在线发表了题为Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species的研究论文。研究人员开发了一种体内策略来定向进化和筛选AAVs衣壳变异体,并成功地进化出了一组含有RGD基序(RGD-motif)的AAV衣壳变异体,能够高效地将基因传递至小鼠或人肌肉组织中。机制和功能探究表明,这些AAV衣壳变异体主要依赖于整合素异二聚体发挥其转导功能,并能够在低剂量全身给药后对肌营养不良症实现明显的治疗效果。
更多解读:
首先,作者开发了DELIVER策略(利用转基因 RNA 的体内表达定向进化AAV衣壳)将多样化的衣壳文库生成与严格的基于转录本的体内选择相结合,实现定向进化,然后在任何感兴趣的组织和动物模型中鉴定功能性衣壳变体。如图1所示,每个变体都包括一个随机的7聚体肽(7-mer peptide),插入到AAV9衣壳高变区VIII的第588位和596位氨基酸之间,这种设计可确保可变肽序列暴露在衣壳表面;每个变体还包含了在广谱性或细胞类型特异性启动子控制下的编码自身衣壳的基因序列,使得衣壳变体可以在HEK293细胞和动物组织中表达。
作者通过定向进化进行了两轮体内筛选,在C57BL/6J小鼠的多种不同肌肉组织中筛选出了由MHCK7启动子表达的衣壳变异体:病毒库测序分析确定了超过 5,000,000个独特的衣壳变体,通过第一轮筛选之后,选出了在7种肌肉组织(股四头肌、胫前肌、腓肠肌、三头肌、腹部、膈肌和心脏)中高度表达的前30,000 个变异体;在第二轮筛选中,作者引入了同义密码子对照和启动子对照(骨骼肌特异性启动子CK8或MHCK7),发现来自CK8或MHCK7文库在肌肉中高度表达的前12种衣壳变体在7聚体插入片段的前三个氨基酸位置包含相同的RGD基序。最后,研究人员筛选出了包含RGDLTTP肽插入的变体进行进一步的功能探究和分析,并将该变体命名为“MyoAAV 1A”。
为了研究全身给药后MyoAAV 1A的转导谱和生物分布,作者给成年C57BL/6J 小鼠注射了1E+12 vg(约4E+13 vg/kg)AAV9-或MyoAAV 1A-CMV-EGFP,并在注射2周后分析不同组织中的转基因表达和载体基因组丰度。组织免疫荧光检测显示,与注射AAV9的小鼠相比较,注射了MyoAAV 1A的小鼠肌肉中的荧光强度更高;MyoAAV 1A注射小鼠肌肉纤维和心肌细胞中的转基因高表达;同时,MyoAAV 1A肝脏转导相对减少。通过对小鼠不同骨骼肌中EGFP mRNA的定量分析发现,与注射AAV9的小鼠相比,注射MyoAAV 1A的肌肉中转基因表达高 10至29倍;在注射了MyoAAV 1A的心脏组织中,EGFP mRNA表达量高6.3倍,肝脏中低2.8倍;值得注意的是,MyoAAV 1A 提高的转导效率仅限于横纹肌组织,与AAV9相比,这种改造的衣壳变体以相似或更低的效率转导了注射动物的肺、肾、脾和脑。这些结果说明全身给药后,MyoAAV 1A可以特异性地高效地转导小鼠肌肉组织。
随后,研究人员探究了MyoAAV 1A体内递送治疗性转基因的可行性。Dystrophin -deficient mdx小鼠是假肥大性肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)的遗传模型(在 Dmd外显子23中携带无义突变)。之前已有研究表明,通过CRISPR-Cas9介导的方法从mdx细胞的基因组中切除外显子23同时表达功能性dystrophin,有益于治疗肌营养不良【1-2】。研究人员向成年mdx小鼠注射AAV9或MyoAAV 1A携带编码SaCas9的构建体(AAV9-Dmd CRISPR和MyoAAV 1A-Dmd CRISPR),以及靶向mdx突变的5’和3’端的引导RNA (gRNAs)。免疫荧光和蛋白质印迹分析证实,与AAV9-Dmd CRISPR相比,注射了MyoAAV 1A-Dmd CRISPR的小鼠肌肉中dystrophin的恢复更显著、更广泛。对AAV-CRISPR治疗的动物胫骨前肌(tibialis anterior,TA)进行的生理学评估表明,MyoAAV 1A-Dmd CRISPR注射的mdx小鼠的各项肌肉功能指标均优于对照组,说明与AAV9相比,MyoAAV 1A 表现出显著增强的将治疗性基因编辑复合物递送至肌肉组织的效力。MyoAAV 1A的基因置换能力在X-连锁肌管肌病(X-linked myotubular myopathy, XLMTM)小鼠模型中得到了进一步的验证。
那么MyoAAV 1A实现肌肉定向转导的分子机制是什么?由于MyoAAV 1A和其他筛选出来的衣壳变体中均存在RGD基序,因此,作者推测RGD结合整合素异二聚体可能在MyoAAV 1A转导中具有重要作用。研究人员在HEK293细胞中转染了编码8种人GRD结合整联蛋白异二聚体的质粒(aIIbb3, a5b1, a8b1, aVb1, aVb3, aVb5, aVb6和aVb8),然后比较这些HEK293细胞中MyoAAV 1A-CMV-Nluc的转导效率。结果显示,过表达a8b1, aVb1, aVb3, aVb6或aVb8可以显著增强MyoAAV 1A-CMV-Nluc的转导效率。两种不同的pan-aV整合素拮抗剂(CWHM-12 和 GLPG-0187)均可以以剂量依赖性方式阻碍小鼠和人原发性骨骼肌肌管中的MyoAAV 1A转导,而对AAV9 转导效率无明显影响。进一步分析发现,在具有促进MyoAAV 1A转导能力的含有aV的整联蛋白异二聚体中,aVb6具有最强的与衣壳变体结合的亲和力。此外,aVb6必须存在于人肌肉细胞的表面,才能使得MyoAAV 1A实现最佳转导。
在后续的研究工作中,作者使用DELIVER策略进行了进一步的体内进化筛选,并获得了第二代 RGD-变异体,MyoAAV 2A。功能探究显示,全身低剂量注射病毒后,MyoAAV 2A具有比MyoAAV 1A更明显的治疗潜力。
总的来说,该研究清楚阐释了一个跨物种的高效肌肉定向AAV衣壳变体家族的进化、改良和表征,并在多个遗传性肌肉疾病小鼠模型中证明了这些载体的治疗功效。研究人员认为,这些载体的开发有利于推进肌肉骨骼疾病的肌肉定向治疗基因传递。同时,本研究中开发的DELIVER系统提供了一个高度适应性的平台,可用于筛选靶向体内任何组织或细胞类型的AAV衣壳变体,极大地扩展了该载体系统跨领域和学科的临床和实验应用。最后,作者希望在其他组织和器官中采用DELIVER系统可以加速人类疾病基因治疗和其他基因组医学方法的开发和转化。
原文链接:
https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.08.028
参考文献:
[1] Nelson, C.E., Hakim, C.H., Ousterout, D.G., et al. (2016). Science 351, 403–407.
[2] Tabebordbar, M., Zhu, K., Cheng, J.K.W., et al. (2016). Science 351, 407–411.
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Science Immunology | HIV治愈新方向:阻断PD-1联合治疗性疫苗发挥威力
2021年9月3日,美国埃默里大学Rama Rao Amara团队,在Science Immunology发表题为 PD-1 blockade and vaccination provide therapeutic benefit against SIV by inducing broad and functional CD8+ T cells in lymphoid tissue 的研究论文,作者使用慢性猿猴免疫缺陷病毒(SIV)/恒河猴模型,在ART治疗下,使用CD40L加TLR7激动剂-佐剂DNA /改良痘苗安卡拉疫苗方案进行治疗性疫苗接种可诱导强效的SIV特异性CD4+和CD8+ T细胞应答。此外,接种疫苗使淋巴结(LNs)中诱导了可归巢到BCF的SIV特异性CD8+ T细胞。在ART开始前和疫苗接种期间给予PD-1阻断剂显著增加了血液和LN中颗粒酶B + 穿孔素 + CD8+T细胞的频率,增强了它们在BCF生发中心的定位,并减少了病毒库。研究结果表明,PD-1阻断剂通过改善和维持疫苗诱导的CD8+ T细胞对BCF的功能和定位、减少淋巴组织中的病毒库,继而增强了SIV疫苗接种的治疗效果。这项工作对制定治疗性HIV策略具有潜在影响。
为了研究PD-1阻断在ART治疗下对治疗性疫苗接种的影响,作者用SIV mac239在直肠内感染了三组恒河猴以诱导慢性感染,并在感染后10周启动ART。随后用CD40L加TLR7激动剂-佐剂的DNA/MVA SIV239疫苗对两组进行免疫,一组仅接种疫苗,另一组使用抗PD-1疗法(疫苗 + PD-1)。第三组未接受疫苗接种或抗PD-1治疗,作为仅接受ART的对照组。疫苗接种包括两次皮内DNA/SIV239-CD40L疫苗初免,然后在第38周(ART启动后28 周)开始每隔4周进行两次肌肉内MVA/SIV239疫苗加强,最后一次MVA加强除外,在第一次MVA提升后14周给予。DNA疫苗表达SIV239 Gag、Pol、包膜(gp160)、Tat、Rev和膜锚定猕猴CD40L蛋白。MVA疫苗表达SIV239 Gag、Pol 和包膜(gp150)。两个疫苗组还在每次DNA疫苗接种后6和24小时接受异位应用咪喹莫特(一种TLR7激动剂)乳膏作为佐剂。
疫苗 + PD-1组分两个阶段接受灵长类动物抗PD-1治疗,第一阶段包括在第0、3、7、10和14天以3 mg/kg剂量在 ART开始前10天开始的五个剂量。第二阶段包括每3周3次10 mg/kg剂量,从ART期间的第一次DNA启动开始。第一阶段的目标是(1)在没有ART的情况下,在慢性病毒复制期间通过PD-1阻断恢复功能失调的CD8+ T细胞应答的功能,以及(2)这些功能性CD8+ T细胞将与ART在启动ART时清除病毒感染的CD4+ T细胞。在ART期间使用PD-1阻断加疫苗接种的主要目标之一,是检测其是否可以进一步增强疫苗接种诱导的T细胞反应的幅度和广度。
具体而言,作者意图评估疫苗接种和PD-1阻断对以下方面的综合影响:1)诱导广泛而有效的抗病毒免疫;2)细胞毒性CD8+ T细胞定位到淋巴组织中;3)减少淋巴结中的病毒库;4)对治疗中断后病毒血症反弹的影响。结果表明,ART期间的治疗性疫苗接种诱导了广泛且功能强大的SIV特异性CD4+和CD8+ T细胞反应,疫苗诱导的SIV特异性CD8+ T细胞表达颗粒酶B(GrzB)并在两个疫苗组中归巢于BCF。然而,与单独接种疫苗相比,接种疫苗加抗PD-1治疗减少了ART期间LN中的病毒库,并保持了ART中断后抗病毒CD8+ T细胞反应的幅度、SIV抗原识别广度和BCF归巢。CD8+ T细胞功能的保持与ART中断后病毒血症反弹和存活率的更好控制有关。这些结果突出涉及疫苗接种和抗PD-1治疗的联合策略在改善和维持功能性CD8+ T细胞反应方面的潜力,从而减少慢性SIV感染期间淋巴组织中的病毒库。
总而言之,本研究使用SIV/猕猴模型评估了将治疗性疫苗接种和PD-1免疫检查点阻断相结合以实现在慢性感染环境中治愈HIV的最终目标的潜力。疫苗 + PD-1阻断的治疗潜力可以通过将其与其他免疫检查点阻断方法相结合来提高,例如PD-1和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(CTLA-4)双重阻断、LRAs(例如AZD5582)、以及抗炎药(例如IL-10和IFNR阻断剂)。然而,结合多种治疗方法也可能增加安全问题。目前,多项临床试验正在进行或已经完成在不同HIV-1感染环境中单独或与其它免疫检查点阻断剂联合使用PD-1阻断疗法的测试,目前尚不清楚这些疗法在HIV感染者中是否安全且可耐受。尽管如此,本研究的发现对开发有效的HIV/AIDS疗法具有潜在意义。
原文链接:
https://www.science.org/doi/10.1126/sciimmunol.abh3034
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资料整理:西湖生物医药综合办公室
文章来源:公开信息搜集