作者首先发现NORAD在细胞内会形成点状的聚集，同样，PUM蛋白也形成类似的结构，并且这两种结构具有明显的共定位，作者将这种结构称为NORAD–PUM (NP) bodies。在DNA损伤后，NORAD在细胞内的含量显著增高，NORAD与PUM共定位的“Foci”结构更明显。敲除NORAD后，PUM蛋白便会弥散在细胞内，不再形成“Foci”结构。NP小体结构与已知的相分离形成的P-bodies 以及 stress granules共定位。为了进一步研究NP小体结构的物理化学性质，作者构建了表达内源PUM-GFP的细胞系，作者发现PUM-GFP在NORAD WT的细胞中，形成Foci”结构，但是在NORAD敲除的细胞中，这种结构不再存在，PUM-GFP弥散地分布于细胞内。进一步的研究发现，NP body具有明显的“液滴”的性质，荧光漂白后能够很快地恢复，两个NP body之间能够相互融合。这些结果表明，NORAD与PUM蛋白肯能能够发生相分离形成NP body，通过相分离形成的NP body，NORAD能够将大量的PUM蛋白sequester在“液滴”内部，从而抑制PUM的活性。这可能可以解释低拷贝数的NORAD是如何调控大量的PUM蛋白的活性这一重要的科学问题。

作者进一步在体外对NORAD以及PUM蛋白的相分离现象进行了深入研究，PUM蛋白具有较长的IDR序列，PUM1 和 PUM2都能够在5uM浓度下，即使没有PEG存在情况下发生相分离。为了证实PUM蛋白能够在细胞内的生理浓度条件下是否能够发生相分离。作者对细胞内的PUM蛋白以及NORAD浓度进行了测定，NORAD在细胞内浓度大约在2-6nM，PUM蛋白约50-200nM。作者发现，在生理浓度150nM下，PUM1自身不能发生相分离，但是当加入生理浓度的NORAD后，PUM1发生了明显的相分离现象，说明了NORAD对于PUM1发生相分离具有明显的促进作用。NORAD的捕鱼PUM结合的突变体，即使在高浓度下也无法促进NORAD的相分离。进一步的研究发现，含有4个及以上的PREs (ND4) 的NORAD transcript可以促进PUM蛋白的相分离，低于4个的无法促进PUM的相分离，说明了NORAD促进PUM蛋白相分离具有特异性，依赖于其余PUM蛋白的特异性结合。

作者进一步研究了NORAD促进PUM蛋白发生相分离的机制，作者发现，RNA与PUM蛋白之间多价的相互作用对于NORAD促进PUM蛋白发生相分离是必须的。证实了NORAD相对于其他的具有PRE元件的mRNA的高拷贝数，以及NORAD 具有18个PRE这两种独特的特性，决定了NORAD对于PUM蛋白相分离的促进作用。

作者检测了NORAD与PUM通过相分离形成的NP body是否竞争性地sequester 大量PUM蛋白，从而抑制了PUM与其target mRNA的结合，从而抑制其功能。通过体外的实验，作者证实了在NP body中，一个PRE element可以结合多个PUM蛋白，也就是是说通过相分离形成的NP body，显著地增加了NORAD的PRE对于PUM的募集能力。竞争结合实验进一步证实了NORAD与PUM形成相分离后能够显著地与mRNA竞争结合PUM蛋白，从而抑制其余mRNA相互作用。作者进一步做了定量的分析，发现NORAD中的每个PRE对于PUM的结合能力大约是在其他mRNA中的单个PRE的42倍。

细胞水平的实验进一步证实了以上结果，细胞内的约400个的NORAD提供了7200个PRE，可以竞争302400个单独的PRE，可以sequester细胞内的大约一半到2/3的PUM蛋白到NP body中。作者计算了细胞内大约有13000-325000个PRE存在，因此在数量级上解释了较少的NORAD可以与细胞内的大量的mRNA中的PRE竞争结合PUM蛋白，从而调控PUM蛋白的功能。

IDR–IDR interactions同样能够促进RBP的相分离，作者猜测，NORAD的多个PRE促进了PUM蛋白的相分离，IDR序列的相互作用进一步促进了相分离NP body的形成，从而使大量的PUM蛋白被NORAD募集在NP body中，从而抑制PUM蛋白的功能。作者分别作了与RNA结合的HD 结构域的突变体，以及IDR区域的突变体。作者发现，RNA并不能够促进PUM1Hdmut的相分离，但是WT  PUM1与RNA形成的droplets却可以高效地募集PUM1Hdmut进入PUM1与RNA形成的droplets。PUM1WTΔIDR也能够被募集到WT  PUM1与RNA形成的droplets中，但是被募集的效率低于WT PUM1.  当HD以及IDR区域都被突变后，将不能在被募集进入PUM1–RNA condensates。这些实验结果进一步在细胞水平得到了验证。

因此，这些实验证实了作者的猜想，即NORAD能够通过多价的相互作用促进PUM的相分离，另一方面形成PUM的IDR区域进一步促进了相分离的形成。

作者进一步验证了是否NORAD对于PUM相分离的促进作用确实将PUM蛋白限制在相分离的液滴中，从而抑制其功能，促进基因组的稳定性。作者发现，当内源的NORAD被抑制后，PUM的target mRNA被显著抑制，当过表达circPRE4–8（大于等于4个PRE）时候，这种抑制作用被消除，而过表达circPRE0–2时候，并无这种效果。另外，在NORAD被抑制表达的细胞中，过表达circPRE0-, or low-valency circPRE1–2的时候细胞在有丝分裂中的chromosome segregation 出现了显著的较多的错误，但是过表达circPRE4 or circPRE8的细胞，这种分裂过程中的不正常的染色体数量显著减少。

综上，作者通过一系列实验，证实了lncRNA NORAD通过促进PUM蛋白的相分离，从而维护基因组稳定性的全新的机制。

RNA通过促进蛋白发生相分离从而维护基因组稳定性这一现象并非首次报道，2019年Nature Cell Biology上就发表了题为 Functional transcription promoters at DNA double-strand breaks mediate RNA-driven phase separation of damage-response factors 的文章，报道了在DNA损伤修复位点产生的RNA可以作为“导火索”促进53BP1的相分离，从而调控DNA损伤修复过程。两篇文章的看似相似的机制，实则不然。这篇文章主旨是RNA通过促进PUM蛋白的相分离将其“围困”在液滴中，从而抑制其活性，维护基因组稳定性。但是NCB的文章是RNA促进了53BP1的相分离，可能为后续相关蛋白的招募提供了一定的反应场所。两篇文章是不同的分子机制。随着研究的深入 ，越来越多的相分离调控DNA损伤修复过程的文章可能会进一步发表，相关的分子机制的研究也会更加深入，对于理解基因组稳定性的维护机制将发挥重要作用。

参考文献：

1. Lee, S., et al., Noncoding RNA NORAD Regulates Genomic Stability by Sequestering PUMILIO Proteins. Cell, 2016. 164(1-2): p. 69-80.

2. Munschauer, M., et al., The NORAD lncRNA assembles a topoisomerase complex critical for genome stability. Nature, 2018. 561(7721): p. 132-136.

使用三维肿瘤模型，他们发现在培养基中的不饱和脂肪酸越多，肿瘤细胞越可能因为一种称为铁死亡（ferroptosis）的机制而死亡。铁死亡是近年来受到关注的一种细胞死亡方式，它是由于某些脂肪酸的过氧化导致的细胞死亡。已经有科学研究表明，基于对铁死亡机制的理解，可能开发出强大的抗癌药物。近日获得6000万美元A轮融资的Kojin Therapeutics公司的最初研发重心就是针对耐药性癌细胞中常见的铁死亡敏感状态。

通常在肿瘤的酸性微环境中，细胞会以脂滴（lipid droplet）的形式存储脂肪，防止它们的氧化，而DHA和相关多不饱和脂肪酸会优先在脂滴中积累。当存在大量DHA时，超出肿瘤细胞脂滴存储容量的DHA会出现过氧化，导致细胞的铁死亡。

而且，研究人员发现，如果使用一种抑制细胞生成脂滴的抑制剂处理肿瘤细胞，能够进一步增强DHA引发的铁死亡。

在小鼠肿瘤模型中，他们也发现食用富含DHA的食物能够降低肿瘤的增殖，同时使用脂质代谢抑制剂或诱导铁死亡的化合物能够进一步增强效果。

论文作者表示，这些数据显示，饮食中的多不饱和脂肪酸可能作为一种辅助性抗癌疗法，与抗癌药物起到“相辅相成”的作用。

参考资料：

[1] An omega-3 that's poison for tumors. Retrieved June 15, 2021, from https://www.sciencedaily.com/releases/2021/06/210611110802.htm

目前自然界中已发现两种m6A去甲基化酶：脂肪质量和肥胖相关蛋白（Fat mass and obesity-associated protein，FTO）和烷基化DNA修复蛋白AlkB同源物5（Alkylated DNA repair protein AlkB homolog 5，ALKBH5）。在本研究中，研究团队发现在不同T细胞亚群中Alkbh5的基因表达水平显著高于Fto，且CD4+ T细胞在受到TCR信号激活后其内部的Alkbh5的基因表达水平进一步提升，而Fto的表达水平未见明显改变，提示ALKBH5可能对CD4+ T细胞的功能发挥具有调控作用。随后研究团队通过构建T细胞中ALKBH5条件性敲除小鼠（Alkbh5flox/floxCd4Cre），发现m6A去甲基化酶的缺失虽然不影响T细胞的稳态维持，但该缺陷小鼠来源的naïve CD4+ T细胞几乎丧失了诱导小鼠过继转输性结肠炎的能力。此外，Alkbh5flox/floxCd4Cre小鼠较野生型小鼠其实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）症状减轻。利用EAE模型进行进一步的机制研究表明，ALKBH5的缺失可以显著增强CD4+ T细胞中干扰素-γ （Interferon-γ，IFN-γ）和C-X-C基序趋化因子配体2（C-X-C motif chemokine ligand 2，CXCL2）mRNA上的m6A修饰水平，从而减少了其mRNA的稳定性以及相应蛋白的表达。这种改变不仅削弱了EAE疾病条件下CD4+ T细胞的效应功能，也减少了后续中性粒细胞向中枢神经系统的趋化，从而缓解了神经系统疾病的严重程度。同时，研究团队也构建了T细胞中FTO条件性敲除小鼠（Ftoflox/floxCd4Cre），发现FTO的缺失既不影响T细胞的稳态维持，也不改变EAE的疾病进展，体现了ALKBH5和FTO对CD4+ T细胞功能调控的差异性和选择性。综上所述，该研究揭示了m6A 去甲基化酶ALKBH5对CD4+ T细胞功能的发挥具有重要的调控作用。

据悉，上海交通大学医学院/上海市免疫学研究所博士后周静和张兴利以及上海交通大学附属瑞金医院核医学科胡佳佳为本论文的共同第一作者，上海市免疫学研究所李华兵研究员及耶鲁大学医学院Richard Flavell教授为该文的共同通讯作者。

原文检索：

https://advances.sciencemag.org/content/7/25/eabg0470

以往的研究表明，C类GPCR二聚体通过调节两个亚基间的相对构象调控受体的功能。此次，上海药物所的联合研究团队通过解析不同代谢型谷氨酸受体的结构，发现不同受体以不同方式形成同源二聚体将各自构象稳定在非活化状态。与之前测定的mGlu5结构类似，mGlu7的非激活态结构呈现一个完全开放的构象，两个亚基的跨膜结构域之间距离较远，没有直接接触。与此不同，mGlu2二聚体中的两个跨膜结构域彼此靠近，通过各自的第四跨膜螺旋（TM4）形成紧密的相互作用。利用氨基酸突变和细胞信号转导实验，研究人员证实mGlu2中的这一二聚体界面是该受体亚型特有的，对于稳定受体的非活性状态发挥着重要的作用。这一发现展示了该类受体功能调控模式的多样性。

与激动剂结合后，受体由非激活态向激活态转变。基于mGlu2分别处于非激活态、激活中间态和完全激活态的结构，该研究团队首次完整阐释了代谢型谷氨酸受体在整个活化过程中的精细构象变化，为深入理解C类GPCR的激活机制提供了关键信息。受体胞外结构域与激动剂结合后，其构象由开放状态转变为闭合状态，带动跨膜结构域大幅度扭转，使两个亚基间的作用界面从TM4-TM4转换为TM6-TM6对称界面；当受体与G蛋白结合时，跨膜结构域进一步扭转，使其中一个亚基的TM5和TM6与另外一个亚基的TM1、TM6和TM7形成一个非对称二聚体界面。进一步的功能研究表明，这种非对称二聚化对于受体激活至关重要，揭示了受体二聚化对其功能调控的精细机制。研究人员还在mGlu4完全激活态结构中发现了类似的二聚化形式，提示不同代谢型谷氨酸受体可能采用相同的活性调控模式。

该研究的另外一项突破是首次为研究代谢型谷氨酸受体的非对称激活机制提供了直接依据。以往的研究结果显示，只有mGlu二聚体中两个亚基的胞外结构域都与激动剂结合时受体才能被完全激活，但最终只有其中一个亚基的跨膜结构域可与G蛋白偶联，这种非对称信号转导机制一直未被准确阐明。mGlu2和mGlu4与G蛋白的复合物结构显示，受体以形成非对称二聚体的方式使两个亚基处于不同的作用环境，影响它们内部的构象重排，导致仅有一个亚基适于结合G蛋白；此外，G蛋白与其中一个亚基结合后，通过形成空间位阻，阻碍另外一个亚基与G蛋白的结合。

以往的研究结果显示， A类和B类GPCR被激活后，TM6向外大幅度迁移，在受体胞内侧区域形成一个较深的结合口袋与G蛋白结合。与此完全不同，mGlu2和mGlu4与G蛋白结合时，受体的TM6并未向外迁移，G蛋白的C末端斜靠在一个由受体胞内侧环区构成的浅槽内，与其他类型GPCR的G蛋白结合模式差异巨大，充分体现了GPCR信号转导机制的特异性和多样化。

此外，联合研究团队还对mGlu异源二聚体的组装和功能调控机制进行了探索。通过对mGlu2-mGlu7异源二聚体开展结构研究，并结合细胞内信号转导、二硫键交联和荧光共振能量转移实验等多种技术手段，发现在该异源二聚体中mGlu7对于二聚体组装和信号转导发挥主导作用。这是首次为mGlu异源二聚化研究提供的结构信息，对于进一步认识该家族受体异源二聚化分子调控机理奠定了坚实的基础。

其中一篇研究论文的第一作者是中国科学院上海药物研究所博士生林淑玲、副研究员韩硕和实验师蔡晓庆。另外一篇研究论文的第一作者是中国科学院大学杭州高等研究院博士后杜娟、中国科学院上海药物研究所博士生王德健和林淑玲、中国科学院生物物理研究所博士生范宏成和台林华以及华中科技大学讲师许婵娟。该项目主要合作者还包括中国科学院上海药物研究所杨德华研究员和周宇研究员、法国功能基因研究所Jean-Philippe Pin教授和Philippe Rondard教授等。

图片：代谢型谷氨酸受体结构示意图。代谢型谷氨酸受体在神经元兴奋中发挥关键作用，是神经精神系统疾病的重要治疗靶点。图中处于不同功能状态的三个mGlu2结构用绿色飘带图表示，从左上到右下依次为非激活态、激活中间态和完全激活态。完全激活态结构中的G蛋白的三个亚基分别用橙色、灰色和蓝色表示。（图片由中国科学院上海药物研究所吴蓓丽研究组提供）

原文检索：

https://www.nature.com/articles/s41586-021-03495-2

https://www.nature.com/articles/s41586-021-03641-w