以anti-PD-1为代表的免疫疗法显著的改善了癌症治疗的格局，但是免疫治疗只在一部分癌症患者中有作用。为了促进下一代免疫治疗的发展，首先需要清楚anti-PD-1治疗的作用机制。研究人员收集了anti-PD-1治疗前后的肺癌患者的肿瘤样本，利用单细胞测序系统地追踪了T细胞在治疗前后的动态变化，并分析了有响应患者和无响应患者之间的差异（图1）。

肿瘤浸润T细胞既包含能够识别肿瘤抗原并杀伤癌细胞的肿瘤特异性T细胞，也包含专门识别非肿瘤抗原例如流感病毒的T细胞，而且在肿瘤中非肿瘤特异性T细胞占了很大一部分比例【1】。因此在分析过程中如何排除非肿瘤特异性T细胞的潜在影响，精准地研究肿瘤特异性T细胞的动态变化是一个挑战。之前的多个研究表明，由于肿瘤抗原的持续刺激，肿瘤中的肿瘤特异性CD8 T细胞克隆会同时高表达T细胞杀伤和“耗竭”相关基因，而非肿瘤特异性CD8 T细胞则不会表达“耗竭”相关基因【2-4】。因此在肿瘤中，耗竭CD8 T细胞可以当作肿瘤特异T细胞的一个替代【5】。

研究人员开发了一套新的分析思路（图1），首先通过聚类分析鉴定了耗竭CD8 T细胞类群，进而以耗竭CD8 T细胞克隆的TCR序列为基础，将所有的CD8 T细胞分为肿瘤特异性CD8 T细胞和非肿瘤特异性CD8 T细胞：根据上面提到的结论和假设，与耗竭CD8 T细胞有完全相同TCR序列的细胞为肿瘤特异性T细胞，剩下的为非肿瘤特异性T细胞。研究发现在有响应的肿瘤当中，治疗显著提高了耗竭信号低的肿瘤特异T细胞前体细胞的比例，表明了PD-1抗体可能阻断了肿瘤特异T细胞向耗竭状态的分化。相反，这一趋势在治疗前和治疗后无响应的肿瘤中并没有观察到。

有效治疗后肿瘤特异T细胞前体细胞的增加有三种可能：1. 耗竭T细胞的逆转；2. 肿瘤中之前存在的前体细胞的扩增；3. 来自肿瘤外例如外周血中的T细胞的补充。研究者通过相关分析排除了第一种可能，强调了后面两种模式的重要性。耗竭T细胞的逆转是领域内长期存在的一种假设，但是之前的小鼠研究表明耗竭T细胞的表观修饰和特征是稳定的，很难改变【6】。研究者对人类肿瘤的分析进一步支持了这一观点。

此外，之前斯坦福大学Howard Chang研究组提出了克隆替代（clonal replacement）的概念，认为治疗后肿瘤中的肿瘤特异T细胞的克隆型都是新出现的【7】。而该研究发现，在肺癌治疗的过程中，新的克隆和之前存在的克隆都会被招募到肿瘤中进而发挥功能（图2）。针对这一现象，研究人员提出了克隆复兴（clonal revival）的概念，拓展了clonal replacement的模式。该研究的科学发现揭示了anti-PD-1疗法在肺癌中的作用机制，为开发新的临床检测与治疗手段提供了新的思路。

北大BIOPIC/生命科学学院博士生刘宝琳，百奥智汇胡学达博士以及301医院丰恺超博士为该论文的并列第一作者。北京大学BIOPIC/生命科学学院张泽民教授和301医院韩为东教授为该论文的共同通讯作者。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s43018-021-00292-8

参考文献：

[1] Simoni et al., Bystander CD8+ T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates, Nature (2018).

[2] Caushi et al., Transcriptional programs of neoantigen-specific TIL in anti-PD-1-treated lung cancers, Nature (2021).

[3] Oliveira et al., Phenotype, specificity and avidity of antitumour CD8+ T cells in melanoma, Nature (2021).

[4] Ahmadzadeh et al. Tumor antigen-specific CD8 T cells infiltrating the tumor express high levels of PD-1 and are functionally impaired. Blood (2009).

[5] van der Leun et al., CD8 + T cell states in human cancer: insights from single-cell analysis, Nat Rev Cancer (2020).

[6] Pauken et al., Epigenetic stability of exhausted T cells limits durability of reinvigoration by PD-1 blockade, Science (2016).

为阐明上述重要问题，陈玲玲团队首先比较了不同方式体外合成环形RNA的效率及免疫原性。目前已知体外合成环形RNA主要有两种途径：基于T4 RNA连接酶的催化直接分子内连接成环，以及基于I型内含子核酶进行自剪接成环。实验结果表明，T4 RNA连接酶合成的环形RNA，包括可作为核酸适配体的环形RNA和可翻译的环形RNA，均不会引起细胞内天然免疫反应，然而通过两种不同I型内含子T4 bacteriophage和Anabeana自剪接形成的环形RNA均能够引起细胞内天然免疫反应。

进一步对不同环化方式合成的环形RNA进行序列和二级结构的比较分析发现，基于T4 RNA连接酶合成的环形RNA，仅引入1到3个外源核苷酸，然而两种I型内含子体外自剪接形成的环形RNA会分别引入74个或186个外源核苷酸。科研人员利用改进的circSHAPE-MaP技术【1】进一步解析了不同途径合成的环形RNA二级结构，发现这些外源序列的引入会改变目的环形RNA的折叠构象，如与环形RNA内部序列配对，或外源序列自身形成了稳定的双链结构。这些结果说明，I型内含子自剪接成环引入的外源序列可能是导致体外合成环形RNA引起细胞内天然免疫反应的原因。

陈玲玲研究组前期工作发现，在系统性红斑狼疮 (SLE) 病人来源的PBMC或T细胞中过表达含有16-26bp短的双链结构的内源环形RNA可抑制PKR及疾病标志基因的异常激活【1】，提示体外合成无免疫源性且含有短的双链结构的环形RNA有望成为治疗自身免疫疾病的全新手段。目前已报道的抑制PKR异常磷酸化激活的小分子化合物，如 2-Aminopurine (2-AP)，oxindole/imidazole derivative compound 16 (C16) 等，均存在一定的局限性。例如，2‐AP存在其它激酶的非特性抑制，而C16 会被体内快速代谢清除且影响细胞正常增殖。研究人员发现通过T4 RNA连接酶合成的环形RNA，不仅免疫原性低，且保留了和体内相似的16-26bp短的双链结构。进一步实验证明，这类体外合成的环形RNA仍然能够在体外及细胞内抑制PKR的激活，并且相对于小分子抑制剂具有约千倍以上更好的抑制效果。

综上，该研究为进一步应用体外合成的环形RNA奠定了重要基础，也为进一步研发基于环形RNA技术的核酸适配体和基因治疗领域带来可期前景。

中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）陈玲玲研究组博士后刘楚霄博士和博士研究生郭思坤为该论文的共同第一作者，陈玲玲研究员为该论文的通讯作者。这项工作得到了中国科学院上海营养与健康研究院杨力研究员，陈玲玲组博士研究生徐奕锋和杨力组南芳博士的大力支持。

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https://doi.org/10.1016/j.molcel.2021.11.019

参考文献：

与大多数人的直观印象不同，早在上世纪70年代末，人们就已发现将真核细胞的细胞核通过超高速离心的方法去除之后，剩余的胞质体（Cytoplast）并不会马上的死亡。在本研究中，研究人员发现，将间充质干细胞的细胞核去除之后，剩余的胞质体在合适的条件下可以持续存活3天左右。这些胞质体具有完整的质膜结构，其膜蛋白的表达和膜表面zeta电位都与完整的细胞类似。尤为引人注意的是，将体外人工合成的mRNA导入到这些胞质体后，它们可以正常的合成包括绿色荧光蛋白（GFP），Gaussa 荧光素酶（Gluc），细胞因子IL-10在内的多种蛋白。其中Gluc和IL-10还可以被正常的分泌到胞外并具有完整的生物学活性。这些结果证明间充质干细胞的胞质体具有完整的蛋白质翻译、合成、修饰、以及分泌的功能，并提示其保有的高尔基体，核糖体，线粒体，及内质网等重要的亚细胞器仍然可以正常地协同工作。通过体外实验，研究人员进一步地发现经过生物工程改造的胞质体，1，可以与细胞黏附因子选择素特异地相互作用；2，通过质膜上复杂的信号传递，其膜上的整合素可以被特定的趋化因子激活，并与内皮细胞上的整合素配体高效地结合；3，根据其质膜上表达的趋化因子受体，这些胞质体还可以向相对应的趋化因子浓度梯度进行主动的趋化运动。这些体外实验的结果提示这些间充质干细胞的胞质体有可能在生物体内具有与完整细胞类似的归巢能力，有潜力实现精准高效地靶向递送。为了与其他的去核细胞加以区分，这种通过物理方法制备的专门用于药物递送的胞质体被命名为了胞质载体（Cargocyte）。

接下来，研究人员在一个精巧的动物疾病模型中检测了胞质载体在体内的归巢与递送能力。细菌来源的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）可以在小鼠一侧的耳部（例如右耳）引发局部的急性炎症反应，而另一侧（例如左耳）却并不会受到影响。利用这一模型，研究人员可以在同一个实验动物中比较静脉注射的胞质载体迁移到炎症组织与相对应的正常组织的数量，从而检测胞质载体针对这一炎症组织的归巢能力。根据在LPS诱导的炎症组织中高表达的趋化因子谱及细胞黏附因子谱（例如Ccl2， SDF-1a，P-selectin， 以及 E-selectin等），研究人员设计改造了胞质载体，使之稳定地高表达相对应的趋化因子受体Cxcr4，Ccr2, 及选择素配体Psgl-1。通过活细胞荧光染色标记，生物发光成像，以及免疫荧光组织化学染色等多种方法，研究人员发现改造后的胞质载体高效特异地迁移到了有炎症的右耳，而几乎不会迁移到没有炎症的左耳。进一步的研究发现改造后的胞质载体在导入外源合成的细胞因子IL-10的mRNA后，可以在小鼠的炎症组织特异高效地表达递送具有生物活性的IL-10蛋白，并且有效地抑制炎症反应以使组织尽快恢复正常。而在另一个小鼠急性胰腺炎模型中，改造后的胞质载体同样可以特异地迁移到疾病部位，高效地递送治疗蛋白并且显著地改善病情。这些实验结果在两个独立的动物疾病模型中首次证明了胞质载体在生物体内的归巢与递送能力，是重要的概念验证型（proof-of-concept）的工作。如何针对特定的疾病来进行胞质载体的设计与改造将是接下来的研究重点。

综上所述，胞质载体是一种介于完整细胞与外泌体之间的新型仿生递送载体。它有与外泌体类似的安全性，同时也有与完整细胞类似的在生物体内的归巢与递送能力。胞质载体具有高生物相容性，低免疫原性，不会导入外源的基因组DNA，没有在体内分化增殖的能力，因此具有高度的临床安全性。胞质载体可以从包括间充质干细胞在内的多种细胞中获得，可以针对特定的疾病组织用多种生物工程的方法来编辑改造，也可以用来递送包括细胞因子，纳米抗体，溶瘤病毒在内的多种生物或化学药物，具有广阔的应用前景 （图2）。

加州大学圣地亚哥分校医学院王华伟博士和博士生Christina Alarcon （现为Takeda California 公司高级病理科学家）为该论文共同第一作者。加州大学圣地亚哥分校医学院Richard Klemke教授为该论文通讯作者。王华伟博士和Richard Klemke教授是相关核心专利（US patent number: US10,927,349 B2; PCT number: WO 2019/032628 A1.）的共同发明人。该专利已于2021年2月获美国国家商标专利局的批准。据悉，王华伟博士已于今年11月全职加入复旦大学粤港澳大湾区精准医学研究院（广州），任职细胞治疗与免疫治疗中心课题组长。课题组将主要聚焦于基于细胞的仿生递送载体的研究，并与复旦大学林鑫华教授团队紧密合作，利用复旦大学遗传工程国家重点实验室的多个平台例如类器官研究平台，针对重大人类疾病例如扩散型恶性肿瘤，开发新型的精准递送载体以及组合型免疫疗法。

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https://www.nature.com/articles/s41551-021-00815-9

大多数新发癌症病例通常在晚期被发现，这使患者失去了最佳治疗机会，导致预后不佳。癌症的早期诊断对于降低死亡率、延长患者生存期、减轻社会负担具有重要意义。由于现有癌症筛查方法成本高、侵入性强、依从性差、准确率低等缺陷，基于现有方法进行大规模癌症筛查既不可行，也不具有成本效益。考虑到癌症的早期诊断可以显著延长患者的生存期，迫切需要开发一种更有效、侵入性更小的新型生物标志物，用于大规模癌症筛查。

N6-甲基腺苷（m6A）修饰作为mRNA中最常见的修饰，也广泛存在于mRNA、miRNA和lncRNA中。m6A修饰水平的失调与肿瘤的发生发展密切相关。最近的研究揭示了几种癌症类型外周血中 m6A 水平的显著失调及其在诊断中的价值。胃癌患者外周血 m6A 水平与健康对照组相比显著上调，且随着胃癌的进展和转移而升高。用于评估 m6A 在胃癌中诊断性能的 AUC 为 0.929，显著大于 CEA 和 CA19-9。乳腺癌患者外周血m6A水平也显著上调，且与分期密切相关，其诊断价值远高于CEA和CA153。白细胞 m6A 水平是非小细胞肺癌的潜在非侵入性筛查、监测和诊断生物标志物。

现有证据表明，m6A 标记作为关键的转录后修饰，促进了 miRNA 生物发生的启动，例如促进初级 microRNA 加工。已证实 m6A 引起的 miRNA 失调在肿瘤转移和进展中起重要作用。血清中循环miRNAs具有较高的稳定性，其表达受室温长期保存和冻融影响较小。上述结果表明，基于外周血中 m6A 靶标 miRNA 的新型诊断生物标志物的开发可能是大规模癌症筛查的潜在策略。

在这项研究中，纳入了包含 12 种癌症类型的 14,965 份血清样本，旨在开发一种基于 m6A 靶向的 miRNA 的血清诊断特征，用于癌症的大规模检测。m6A-miRNAs 特征显示出较高的准确性，其在训练、内部验证和外部验证队列中的曲线下面积 (AUC) 分别达到 0.979、0.976 和 0.936。此外，在区分癌症类型的性能方面，m6A-miRNAs 特征在每种癌症类型中都表现出优异的敏感性，并在识别肺癌、胃癌和肝细胞癌方面表现出令人满意的 AUC。

m6A-miRNAs的诊断性能也不受性别、年龄和良性疾病的干扰。总之，该研究揭示了血清循环 m6A miRNA 在癌症检测中的价值，并为开发具有高精度、低成本和低侵袭性的新型生物标志物提供了新的方向和策略，用于大规模癌症筛查，例如 RNA 修饰。

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https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-021-01477-6

诱导型共刺激分子 ICOS 在 CD4+ 辅助T 细胞分化中具有明确的作用，其对生发中心反应中滤泡辅助细胞(Tfh)的分化至关重要。然而，ICOS 在 CD8+ 细胞毒性T 细胞分化中的作用尚不清楚。首先通过不同的病毒或细菌急性感染模型，研究人员发现ICOS缺陷的CD8+T细胞，数量上与野生型相比，在外周的循环记忆T细胞中并没有差别，然而在非淋巴组织中的驻留记忆细胞中却展现出特异性显著缺失。这一发现与之前报道中ICOS基因作为 CD8+ 驻留细胞高表达的特征相互印证。通过对感染后不同时间点的研究进一步发现：ICOS缺失或阻断并不影响CD8+T细胞的初始激活或效应细胞的扩增，其能在感染初期与野生型同等有效地迁移至非淋巴组织中，但在随后组织内的进一步分化成熟的过程中出现缺陷。与此相反，对成熟后的CD8+驻留记忆细胞的ICOS信号进行阻断并不会对其长期的维持产生影响。

为了进一步确定ICOS对于CD8+ 驻留记忆细胞产生作用的时间和机制，研究人员利用过继转移（adoptive transfer）的方式表明：CD8+T细胞在感染初期于淋巴组织内激活增殖阶段是否接受ICOS的共刺激信号对于之后在正常非淋巴组织中成熟分化为Trm并没有作用；相反，将初期正常接受ICOS共刺激信号的CD8+效应T细胞过继转移至ICOS-L缺失的小鼠中则会对其之后在非淋巴组织中Trm的分化产生阻碍。由于ICOS的配体 ICOS-L广泛表达于各种抗原呈递细胞以及非淋巴组织的基质细胞和上皮细胞之中，介导CD8+ Trm的ICOS共刺激信号来源很难确定。研究人员通过骨髓转移的嵌合体（bone marrow chimera）研究表明：与CD4+ Tfh利用淋巴器官中B细胞作为ICOS-L来源不同，CD8+ Trm的ICOS-L共刺激信号来源于非淋巴组织内对放射线不敏感的细胞群里——包括了非造血干细胞起源的细胞群体或者是组织内驻留的抗原呈递细胞等。

最后，通过单细胞测序对感染初期的以及成熟记忆期的野生型和ICOS缺失的CD8+T细胞进行比对，研究人员从转录组上证明了ICOS缺失的CD8+组织驻留细胞与野生型差异非常小。这反应了ICOS作为组织内的共刺激信号主要介导CD8+驻留细胞分化成熟的效率而并不影响其质量。进一步的分子机制研究表明，ICOS介导的PI3K信号以及其下游转录因子KLF2在CD8+T细胞的组织驻留过程中扮演了重要角色。

综上所示，该研究表明了经典共刺激分子ICOS在CD8+T淋巴细胞分化中的作用——能够特异性地高效诱导组织中的驻留记忆细胞的产生而不影响外周循环记忆细胞。此外，ICOS共刺激信号主要作用于CD8+T淋巴细胞迁移至非淋巴组织之后，且由本地的放射线不敏感细胞群体介导，这为组织微环境在组织驻留记忆细胞的分化成熟中的作用开辟了新途径。介于组织驻留记忆细胞对于疫苗的有效性以及其与肿瘤浸润细胞的高度相似性，针对ICOS/ICOS-L共刺激信号的靶点能够成为相关疾病治疗的新思路。

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https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.11.017

肾细胞癌(RCC)至少占恶性疾病的3%，是泌尿系统恶性肿瘤相关死亡的第二大原因。透明细胞肾细胞癌 (ccRCC) 占 RCC 的 80-90%，与其他 RCC 亚型相比，具有更高的侵袭能力和更高的复发率。在过去的几十年里，ccRCC 的发病率和死亡率似乎在迅速增加。由于局部复发和远处转移，患者的总体生存率并不令人满意。因此，有必要进一步研究促进 ccRCC 发展和进展的分子机制。

在过去的几十年里，由于高通量测序的发展，在哺乳动物细胞中发现了大量的 circRNA。越来越多的证据表明，circRNA 可能参与了许多疾病的进展，包括癌症。例如，hsa_circ_001783 通过海绵 miR-200c-3p 促进乳腺癌细胞的进展。circ-CPA4 通过 let-7 miRNA/PD-L1 轴调节 NSCLC 细胞中的细胞生长、干性和耐药性，并在肿瘤免疫微环境中灭活 CD8+ T 细胞。而 Hsa_circ_0058124 通过 NOTCH3/GATAD2A 轴促进甲状腺乳头状癌的发生和侵袭。circRNA hsa_circ_002577 通过充当 miR-625-5p 海绵、上调 IGF1R 和激活 PI3K/Akt 通路来加速 EC 进展。

尽管已报道多种 circRNA 可调节肿瘤进展，但 circRNA 在 ccRCC 中的功能作用仍然未知。已经表明 circTLK1 通过海绵 miR-136-5p 在 RCC 进展中发挥关键作用，这会增加 CBX4 的表达，并且 circTLK1 可能作为 RCC 的诊断生物标志物和治疗靶点。hsa_circ_001895 可能海绵 miR-296-5p 并促进 SOX12 表达，这是 hsa_circ_001895 诱导 ccRCC 进展的潜在机制。

在这项工作中，发现了一种新的 circRNA，称为 hsa_circ_0020303，它在 ccRCC 标本中上调并与 ccRCC 患者的不良预后相关。该研究确定 circCHST15 通过直接结合 miR-125a-5p 以减弱 miR-125a-5p 介导的 EIF4EBP1 抑制，来促进 ccRCC 的增殖和转移。总之，该研究结果将 circCHST15 确定为 ccRCC 中潜在的新型预后生物标志物和治疗靶点。

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https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-021-01449-w

结直肠癌(CRC)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，是世界上癌症相关死亡的第二大原因。美国国家综合癌症网络 (NCCN) 指南推荐手术联合放疗和化疗作为 CRC 的标准治疗方法。虽然结直肠癌的治疗有所改善，但不幸的是结直肠癌的预后仍然不令人满意，主要是由于结直肠癌的肿瘤发生机制尚不清楚和侵袭性；每年约有880,000 名 CRC 患者死亡。因此，迫切需要了解和探索CRC恶性进展的潜在机制，以提高诊断效率、治疗效果和预后。

环状 RNA (circRNA) 是一类新型的双功能RNA，具有非编码和有限的蛋白质编码功能，由前体 mRNA 的非经典反剪接连接位点产生，以共价闭合的单链环结构为特征。由于缺少 5' 帽和 3' 多聚 A 尾，circRNA 对核酸外切酶具有抗性，并且比它们的线性 RNA 对应物更稳定。此外，随着高通量测序结合现有生物信息学分析技术的发展，越来越多的证据表明circRNA在包括CRC在内的恶性癌症中广泛表达、普遍稳定、高度保守和组织或细胞特异性。例如，据报道 circRNA ciRS-7-A、circNSUN2 和 circ-ERBIN 在 CRC 中过度表达并促进其进展。

circRNA 可以通过充当 microRNA (miRNA) 海绵并与 RNA 结合蛋白 (RBP) 相互作用来发挥其生物学功能。此外，一些 circRNA 可以作为蛋白质的翻译模板或支架或 RNA 剪接和基因转录的调节剂。异常表达的 circRNA 还通过调节多种信号通路的活性在介导癌症进展中发挥重要作用，例如 WNT/β-catenin、MAPK、JAK/STAT、NOTCH 和 PI3K/AKT 通路。据报道，circPPP1R12A 通过 Hippo-YAP 信号通路促进结肠癌的发病和转移。综上所述，circRNA 可以作为 CRC 诊断和预后预测的潜在生物标志物，以及有效的治疗靶点和信号通路的重要调节因子。

TRIM29（也称为 ATDC）是tripartite motif蛋白家族的成员，已被证明在各种癌症中发挥致癌作用，包括胰腺癌、甲状腺癌、膀胱癌和 CRC 。越来越多的研究证实，circRNAs通过调节靶基因在多种恶性肿瘤的发生和进展中发挥作用。因此，研究circRNAs与TRIM29的关系对于探索TRIM29的上游调控以及开发有前景的CRC治疗靶点具有重要意义。

近年来，circRNA 的异常表达和调控轴已在多种恶性肿瘤中得到阐明和描述。然而，关于circRNAs在CRC中的作用仅进行了初步研究，并且在CRC中新型circRNAs的临床意义、水平、生物学功能和分子机制在很大程度上仍有待探索。

在本研究中，基于生物信息学分析，鉴定了一种新的 CRC 相关 circRNA (hsa_circ_0038718)，其来源于 IL4R 基因的外显子 3 和 4，也称为 circIL4R。circIL4R在CRC中的表达和功能尚不清楚。因此，首先进行原位杂交 (ISH) 和 qRT-PCR 测定以确定 circIL4R 的水平及其表达的临床意义。随后，在体外和体内进行了功能获得和丧失实验，以鉴定 circIL4R 在 CRC 中的生物学功能和分子机制。

更准确地说，一系列实验，如染色质免疫沉淀（ChIP）、荧光素酶报告基因和生物素化 RNA 下拉测定，表明 TFAP2C 诱导的 circIL4R 可以充当 miR-761 的海绵以增强 TRIM29 表达，并强制过度表达TRIM29促进泛素介导的PHLPP1降解，激活PI3K/AKT信号通路，促进CRC细胞增殖和转移。总的来说，该研究结果表明，circIL4R 可以作为一种新的诊断和预后生物标志物以及有希望的 CRC 治疗靶点。

原文链接：

https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-021-01474-9