Infigratinib 是一种目前正在临床开发和应用于乳腺癌和其他实体瘤的FGFR抑制剂。为了系统的鉴定infigratinib的潜在联合用药靶点，作者选用了对于infigratinib 适中敏感的三阴性乳腺癌细胞系进行全基因组 CRISPR 基因敲除筛选，鉴定了调控细胞生长的关键因子mTOR 和 YAP的敲除可增加药物敏感性，而参与染色质重塑的SWI/SNF 复合物成员 ARID1A 与BRG1 的失活会导致细胞出现耐药性。与CRISPR 基因敲除筛选结果一致的是，长时间infigratinib处理会同样导致肿瘤细胞中mTORC1复合体的激活。有趣的是，YAP信号的靶基因以及多种氨基酸转运蛋白如SLC1A5，SLC7A5，SLC3A2等是在耐药过程中最显著上调的转录物和蛋白质。TNBC细胞内几种氨基酸，包括谷氨酰胺、精氨酸和亮氨酸，均在FGFR 抑制过程中大量积累。这些发现说明对 FGFR 抑制剂的适应性耐药性是由增加的氨基酸转运介导的，并导致 mTORC1 复合体的激活。

这些结果表明，氨基酸转运蛋白在耐药过程中的高度表达很有可能与表观遗传变化有关。作者接下来发现FGFR抑制剂的长期处理导致了增强子在染色质开放区域高度激活，并且这些染色质区域含有大量的YAP/TEAD DNA 结合基序（motif）。几种氨基酸转运蛋白的增强子均在耐药过程中被激活并且可与YAP转录因子结合。而且，SWI/SNF 复合体及其核心蛋白BRG1的染色质结合谱也与YAP/TEAD 结合位点高度重合，但是对FGFR的抑制导致了BRG1从染色质上解离。与耐药过程相似的是，在TNBC细胞中敲除BRG1极大的促进了YAP依赖性增强子的激活以及YAP靶基因的转录。

为了开发了精准性组合疗法用于潜在的临床转化，作者在FGFR基因异常的TNBC病人来源肿瘤异种模型（PDX）中测试了infigratinib与 mTOR抑制剂依维莫司或 YAP 抑制剂CA3联用的治疗效果。在大多数情况下，两种药物组合都可将肿瘤生长降低到基线以下，并显著抑制了肿瘤生长。鉴于infigratinib 和依维莫司在一些国家已经用于临床肿瘤治疗，靶向FGFR和mTORC1的联合用药方案可以快速的转化为临床试验，在其它FGFR异常表达的肿瘤中也具有潜在的临床应用前景。

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研究团队首先在体外验证了制备的PD-L1xCD3能够同时结合PD-L1和CD3ε，并能够以PD-L1依赖的方式刺激T细胞活化并分泌IFNγ，杀伤肿瘤细胞。体内实验进一步表明PD-L1xCD3能够在MC38模型上产生良好的抗肿瘤效果并优于anti-PD-L1和anti-CD3的联合治疗，从而表明PD-L1xCD3具有其独特的作用机制。通过细胞过继转移和删除实验表明，PD-L1xCD3能够诱导抗原特异性CD8 T细胞反应并产生免疫记忆，而这一现象依赖于肿瘤内预存的CD8 T 细胞。

为了研究PD-L1xCD3是否比传统的TAAxCD3具有更强的抗肿瘤效果，作者们制备了靶向TAA的ErbxCD3双特异性抗体，并通过体外实验证明其具有与PDL1xCD3相似的亲和力，激活T细胞能力和肿瘤细胞杀伤能力。然而体内实验却表明，在相同剂量下PD-L1xCD3比ErbxCD3展现出了更强的抗肿瘤效果，并且这一现象在TC1，B16F10，TuBo等多种模型上均得到了验证，提示靶向免疫检验点PD-L1的双特异性抗体比靶向TAA具有更好的激活T细胞能力。

为了进一步探究产生这种区别的本质原因，作者们首先通过在不同的细胞上敲除了PD-L1来探寻哪种细胞表达的PD-L1对于PD-L1xCD3在体内的抗肿瘤效果是必须的。出乎意料的是，尽管肿瘤细胞本身是最主要的PD-L1阳性的细胞，但敲除肿瘤细胞上的PD-L1并没有影响PD-L1xCD3的治疗效果。与之相反，敲除宿主细胞上的PD-L1却彻底废除了PD-L1xCD3的治疗效果。通过条件性PD-L1敲除小鼠实验表明，树突状细胞而并非巨噬细胞表达的PD-L1起到了至关重要的作用。作者进一步利用Batf3敲除小鼠确认树突状细胞亚群（cDC1）对于PD-L1xCD3的治疗效果是不可或缺的。前期研究表明，anti-PD-(L)1 治疗能够通过增强B7-1(CD80) 与CD28的相互作用来达到激活T 细胞的效果【1,2】。由此，研究人员提出了PD-L1xCD3治疗是通过增强共刺激信号来发挥作用的假设。结果也表明，用抗体阻断CD80/86后，PD-L1xCD3的治疗效果消失同时抗原特异性T细胞反应也大大减弱。通过体外共培养实验证明，PD-L1xCD3能够通过增强共刺激信号的方式促进IL-2的分泌，避免T细胞因过度激活导致的凋亡，从而实现肿瘤内T细胞的长效激活。

传统BiTE的设计理念是通过单链抗体（ScFv）衔接T细胞与肿瘤细胞，促使T细胞活化并直接进行肿瘤细胞杀伤。然而，在肿瘤微环境里T细胞的数量和质量都非常有限。而肿瘤细胞不仅数量“占优”并且能够通过激活抑制性信号通路（如PD-L1/PD-1）来逃逸杀伤。与此同时，由于肿瘤细胞本身并不表达共刺激分子，其激活T细胞的效果非常有限。面对数倍于己的“敌军”，T细胞在反复杀伤的过程中很容易产生耗竭而败下阵来。与之相反，作为新型双特异性抗体，PD-L1xCD3能够将T细胞与树突状细胞衔接在一起，从而为其激活提供充足的条件（共刺激分子）。通过与树突状细胞的相互作用，T细胞不仅得到了有效的激活并且能够通过IL-2实现自我扩增。最终实现T细胞的持续性激活并获得持久的抗肿瘤免疫反应。

综上所述，该研究为新一代双特异性抗体设计提供了思路。证明了PD-L1xCD3 具有优于传统BiTE的如下特点：1）靶向肿瘤组织降低毒性；2）阻断PD-L1/PD-1相互作用，解除T细胞抑制；3）靶向DC细胞为T细胞激活提供共刺激信号，从而促进IL-2介导的T细胞存活。

据悉，该论文已被选为Nature Biomedical Engineering 杂志11月份的封面故事。

该研究的通讯作者是美国德克萨斯大学西南医学中心的乔健博士和傅阳心教授。刘龙超博士为论文的第一作者。

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https://www.nature.com/articles/s41551-021-00800-2

参考文献：

1. Hui, E. et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science 355, 1428-1433 (2017).

研究人员首先进行大数据分析肿瘤微环境中各种免疫抑制性细胞 (如 Tregs， MDSC， TAM.M2)是否有共有的靶点。该研究中发现肿瘤微环境中各种免疫抑制性细胞相比较非抑制性细胞均高表达CD73这个膜表面蛋白。对此研究人员引入了一种刚刚被日本临床批准的肿瘤治疗新方案即光免疫疗法【1】 (Photoimmunotherapy)，将一种特定光吸收剂与CD73抗体相欧联（下图上），这种光吸收剂在近红外光的照射下可以快速诱导能与CD73抗体结合的细胞坏死。

研究人员通过这种能同时杀死肿瘤微环境中各种免疫抑制性细胞和表达CD73的肿瘤细胞的方案，在小鼠三阴性乳腺癌中成功克服了PD-1抗体治疗中出现的获得性抗性问题。但是数据也显示任何一种免疫抑制性细胞的残存都可以导致治疗的后期复发问题，这提示同时杀伤全部类型免疫抑制细胞的重要性。

最后研究人员也使用了肿瘤表面不表达CD73小鼠胰腺癌肿瘤模型，发现即使肿瘤表面不表达CD73，单纯通过光免疫疗法杀死肿瘤微环境中的免疫抑制性细胞也成功克服了PD-1抗体疗法在胰腺癌中出现的初始抗性问题。

这项研究工作为克服PD-1抗体在临床应用中出现的初始抗性问题和获得性抗性问题可供了应用性极强的解决方案，很大程度上扩宽了肿瘤治疗中PD-1抗体的临床应用范围。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41551-021-00799-6

参考文献：

杨巍维组合作研究发现，丝氨酸合成通路中的关键酶PHGDH的单泛素化修饰促进了CRC转移。泛素连接酶复合体Cul4A-DDB1介导的PHGDH K146位点的单泛素化修饰促进了PHGDH和分子伴侣DNAJA1的相互作用，从而促进了PHGDH四聚体的形成，上调了PHGDH的酶活；PHGDH活性的升高增加了细胞中其下游代谢物SAM的含量；高水平的SAM选择性激活了甲基转移酶SETD1A，促进了细胞黏附基因LAMC2和CYR61启动子的组蛋白H3K4的三甲基化（H3K4me3）修饰，从而促进了LAMC2和CYR61的表达及CRC的肝转移。

通过对大量CRC病人样本分析，他们发现相较于CRC原位端肿瘤组织，肝转移端肿瘤组织中的SAM含量更高；相较于无转移复发的CRC病人，有转移复发的CRC病人血清中SAM的含量更高。

该工作发现了丝氨酸代谢调控促进CRC转移的新功能；揭示了单泛素化修饰调控PHGDH活性及SAM生成促进CRC转移的新机制；提示了阻断丝氨酸合成通路可以抑制CRC肝转移，以及肿瘤组织和血清中SAM的含量可以预测CRC转移及预后。

杨巍维研究员、复旦大学附属肿瘤医院李大卫教授、李心翔教授和广州大学王雄军教授为该论文的共同通讯作者。杨巍维组张亚娟博士、广州大学喻华博士和上海科技大学张洁博士为该论文的共同第一作者。

原文链接：

https://www.jci.org/articles/view/146187

为了对衰老细胞在分子水平上进行更深入的了解，作者们希望鉴定衰老相关的超级增强子所控制的基因。在最初的筛选中，作者们使用了小鼠胚胎成纤维细胞这一体外系统，并且应用在三种不同的衰老诱导应激胁迫条件：γ-射线、过度复制以及癌基因诱导。作者们绘制了细胞过渡到衰老状态后超级增强子以及与这些超级增强子相关的转录激活基因，从中作者们找到了p21这个被调控的基因位点。p21是一个传统的细胞周期抑制因子，在筛选中发现该基因位点引发了作者们的兴趣， 这可能暗示了p21在衰老细胞中还具有其他的功能。

为此，作者们在细胞中敲降了p21，发现衰老相关的基因表达中有三分之一是p21依赖的，因此作者们将这种表型称为p21激活的分泌表型（p21-activated secretory phenotype，PASP）。在受到影响的因子中，作者们将目光集中在Rb（Retinoblastoma protein）蛋白之上，因为在p21敲降后Rb在衰老细胞中缺失并且会降低衰老相关分泌表型的减弱。因此，p21是通过降低Rb的磷酸化对SASP产生影响。

为了进一步地探究p21介导的Rb低磷酸化水平是如何激活衰老相关分泌表型基因的，作者们对调控不同衰老相关进转录因子以及不同衰老条件所产生的RNA-seq数据进行分析。作者们发现Rb会促进衰老细胞中这些关键转录因子的转录活性，从而建立起p21依赖的衰老相关分泌表型的产生。另外，作者们还发现p21所控制的转录程序是响应应激胁迫的第一道关，会在细胞周期阻滞的情况下开启机体的免疫监控。

但是p21的这种免疫监控是如何开启的呢？作者们对衰老相关的分泌表型因子进行分析，发现小鼠胚胎成纤维细胞来源的p21依赖的分泌因子中包括Cxcl14，这是CXC家族趋化因子之一，会作为多种免疫细胞化学引诱剂发挥作用【1】。为了验证p21是否是由CXCL14开启机体的免疫监控的，作者们在实验系统中加入了CXCL14中和抗体，发现在加入后巨噬细胞被引诱后迁移的现象会消失。为了进一步在体内的系统证明这一观点，作者们对构建了标记的p21小鼠品系，p21过表达后肝脏细胞会出现显著的衰老特征，比如laminB1缺失以及HMGB1的核挤出等。但是随着时间的流逝，p21过表达的肝脏细胞数量显著降低，说明这些衰老的细胞会被清除。而再加入中和抗体后，衰老细胞的清除现象就会消失。

那么p21所介导的衰老分泌表型因子的是否是特异的呢？为此作者们构建了p16以及p27的过表达品系。p16与p21相比是一个更为特异的细胞周期依赖性激酶抑制因子，只靶向G1-CDK。作者们发现p16也会出现显著的细胞周期抑制，但是并不能促进巨噬细胞的迁移。同样的，p27会作为在细胞终末分化的细胞周期发挥作用，而不似p21。因此，细胞周期阻滞与免疫监控是p21而非其他细胞周期依赖性抑制因子的特征。

通过癌变诱导的应激胁迫，作者们证明了在癌基因诱发的应激胁迫中p21所介导的免疫监控作用也会发挥功效，从而作为应对胁迫的第一道防线保护机体的健康和稳态。但应激诱导的致癌点突变是不可修复的，但细胞一般来说遇到的很多应激胁迫都是短暂的或者是可以修复的。那么p21依赖的衰老分泌表型是否可以对可逆的应激胁迫进行响应呢？作者们构建了慢病毒载体的p21小鼠品系，在阿霉素（Dox）作用的情况下会产生符合p21过表达的表型，而在去除阿霉素后p21的水平会逐渐恢复正常，作者们发现p21恢复正常水平后，p21依赖的衰老分泌表型缓解下来，巨噬细胞会从应激胁迫的上释放，细胞的免疫监控状态停止。

总的来说，该工作鉴定发现了经典的细胞周期蛋白依赖性激酶p21在应激状态下作用“侦察兵”发挥免疫监控作用（图1），通过促进细胞释放趋化因子CXCL14等招募巨噬细胞，清除机体中危险的存在，同时又具有生物内在“计时器”功能，在应激胁迫撤出的情况下促进衰老分泌表型的缓解，从而解除多细胞内的警报，促使机体恢复正常状况。

同期刊发观点文章对该文章进行介绍题为Clearing stressed cells，介绍了该工作中鉴定发现p21不仅对于衰老细胞的周期阻滞有关，还会早期阶段对受到胁迫的细胞进行免疫监控，清除受到胁迫的细胞。在细胞对内在环境进行修复，促使p21恢复正常水平后，可以使得巨噬细胞解离。但是应激胁迫造成的威胁超过细胞的修复能力后，细胞依赖于p21所释放的CXCL14等在内的趋化因子会招募巨噬细胞，巨噬细胞激活后招募T细胞，从而维护多细胞内环境的稳态。

原文链接：

https://doi.org/10.1126/science.abb3420

参考文献：

1 Nara, N. et al. Disruption of CXC motif chemokine ligand-14 in mice ameliorates obesity-induced insulin resistance. The Journal of biological chemistry 282, 30794-30803, doi:10.1074/jbc.M700412200 (2007).

GO 分析发现KDM5B的表达与免疫系统过程呈负相关。细致分析发现KDM5B与T细胞标志物、抗原递呈以及细胞因子表达呈负相关，尤其包括关键的效应细胞因子IFNγ 和TNF和T细胞趋化因子CXCL9，CXCL10。作者对临床中抗PD-1治疗之前的黑色素瘤样本进行转录组分析发现对ICB（immune checkpoint blockade）反应性较好的患者，KDM5B表达水平明显较低。对ICB无反应的患者KDM5B表达较高。这些结果表明KDM5B与肿瘤炎症水平呈负相关，可作为ICB反应不佳的标志分子，因此靶向KDM5B可能会促进T细胞浸润并克服ICB治疗抵抗。

接下来作者利用免疫原性YUMMER1.7小鼠黑色素瘤模型进行体内实验发现KDM5B敲除组多克隆肿瘤细胞被小鼠完全排斥，对照组则形成肿瘤。而且再次植入KDM5B敲除细胞也无法成功，证明免疫记忆的形成。进一步分析发现KDM5B缺失的肿瘤中T细胞明显增加，尤其是CD8+T细胞，肿瘤细胞死亡增加。使用单细胞衍生克隆也获得一致的实验结果。而使用RAG1-/-小鼠时，实验组和对照组的差异明显缩小。利用免疫原性较低的YUMM1. 7细胞系也得到了类似的结果。而且KDM5B敲除能够增加对抗PD-1治疗的敏感性。

对KDM5B-KO和对照组YUMMER1.7细胞进行转录组GSEA发现敲除组细胞中I型干扰素通路明显激活，包括RIG-I和DNA-sense通路。MDA5 RIG-I MAVS cGAS以及TBK1 IRF3 STAT1表达都明显增加。这表明KDM5B敲除对于I型干扰素通路激活至关重要。I型干扰素是MHC I分子的正向调节分子，而作者也发现KDM5B的敲除确实也增加了MHC I分子表达。

利用链特异性RNA-aeq分析显示来自于逆转录元件的转录本明显增加，包括含有长末端重复序列（long terminal repeat LTR）的内源性逆转录病毒（endogenous retroviruses ERV）和非LTR元件。作者也发现在KDM5B表达低的患者中双链RNA水平高于KDM5B表达高的患者。敲除KDM5B后表达增加最明显的ERV是MMVL30。敲降MMVL30后发现ISG的表达明显降低。利用CHIP-qPCR分析发现KDM5B结合到逆转录元件位点，而这些位点的H3K4me3水平无明显变化，这表明KDM5B的这些作用与其去甲基化活性无关。H3K27me3甲基转移酶抑制剂对MMVL30和ISG表达影响较小，H3K9me3甲基化转移酶抑制剂则以剂量依赖的方式促进MMVL30和ISG的表达。而检测发现在KDM5B敲除细胞中SETDB1在逆转录元件位点的结合降低。CHIP-seq分析发现KDM5B和SETDB1结合峰重叠61.2%，其中包括含有LTR的ERV。在KDM5B敲除的细胞中，表达增加逆转录元件位点的H3K9me3水平也因KDM5B敲除而降低。ATAC-seq分析发现KDM5B的缺失增加全细胞的染色质可及性，特别是转座元件位点。

作者最后用人黑色素瘤细胞系也验证了KDM5B的敲除可以促进ERV和ISG的表达。患者样本中ERV和KDM5B表达呈负相关。例如ERVmap_2637在抗PD-1治疗具有完全反应的患者中表达显著升高。然而KDM5A KDM5C KDM5D与抗PD1治疗反应性无关。

本研究表明阻断KDM5B或阻断KDM5B-SETDB1相互作用可以有效提高抗肿瘤免疫反应，克服ICB治疗抵抗。未来还需鉴定KDM5B缺失诱导而来的抗原以及其在免疫记忆反应中的关键作用。

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https://doi.org/10.1038/s41586-021-03994-2

考虑到USP30在抑制线粒体自噬和调节CTLs功能中的重要作用，该团队首先通过USP30缺陷小鼠观察到CTLs中线粒体数量和形态均发生显著变化（图1），且氧化磷酸化、耗氧率等线粒体功能受损，相较于野生型小鼠产生的CTLs而言，USP30 KO CTLs显示出对糖酵解更大的依赖性。这些改变伴随着CTLs持续杀伤能力的丢失，比如在短期杀伤试验中，CTLs数量与靶细胞超过25:1时，USP30 KO CTLs仅能杀死40%的靶细胞，而WT CTLs可以杀死全部靶细胞，而长期测定表明，USP30 KO CTLs杀死所有靶细胞的时间几乎是WT CTLs的两倍。

那么造成这种杀伤能力减弱的原因是什么呢？该团队依次证明了CTLs的运动性、总ATP浓度、以及响应TCR刺激的信号传导和颗粒释放等在KO CTLs中都不受影响，看似所有步骤都完好无损。随后，该团队继续检查包含溶细胞蛋白的分泌颗粒是否受到影响，有趣的是，虽然数量相似，但USP30 KO CTLs中的颗粒明显更小，且颗粒酶B表达量以及穿孔素的成熟水平也明显降低，而相应的mRNA水平没有差异。通过掺入甲硫氨酸类似物高HPG监测蛋白质合成进一步确认，这些溶细胞蛋白的翻译障碍可能是导致USP30 KO CTLs杀伤能力缺陷的原因。

为了确认翻译缺陷是否同等影响所有蛋白，该团队使用质谱法比较了TCR激活前后WT和USP30 KO CTLs的蛋白质组。结果发现，仅一部分蛋白在USP30 KO CTLs中具有显著降低的表达，其中，受影响最大的是线粒体蛋白（72%），其次便是溶细胞蛋白。需要注意的是，线粒体核糖体蛋白代表了TCR刺激前后线粒体中下调幅度最大的亚群之一，而胞质核糖体并未受到影响，说明在KO CTLs中观察到的翻译缺陷并非由胞质核糖体含量缺陷所引起。为了直接解决线粒体蛋白翻译在 CTLs杀伤中的作用，该团队使用强力霉素（DOX）破坏了线粒体蛋白翻译，处理4小时后，CTLs细胞毒性被抑制，与KO CTLs表型一致。

在免疫反应早期，单个CTL对于靶细胞的连续杀伤对于反应的成功至关重要。这项工作发现CTLs的这一能力由线粒体介导，线粒体翻译对于溶细胞蛋白的产生非常重要，通过这种方式，线粒体在高代谢需求时充当稳态调节器，并在CTLs持续杀伤中发挥关键作用。

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