异常增强的 DNA 损伤修复导致多种癌症的治疗耐药 。最近，长链非编码 RNA (lncRNA) 已被证明是 DNA 损伤修复不可或缺的参与者，并为克服癌症耐药性提供了新的靶点。然而，大多数 lncRNA 在 DNA 损伤修复中的确切作用仍然未知。在这里，该研究发现lncRNA ANRIL 通过介导 DNA 损伤的同源重组 (HR) 修复来促进癌症抗性。

具有高 ANRIL 表达的肺癌是全世界死亡的主要原因，并被选为模型来研究 ANRIL 在 DNA 损伤修复和治疗抵抗中的作用。首先，与来自 80 对临床标本的邻近正常组织相比，在肺癌组织中发现 ANRIL 显著升高。与正常 BEAS-2B 细胞相比，肺癌细胞中也证实了 ANRIL 的高表达。通过分析来自 TCGA 数据库的数据，还发现 ANRIL 在肺鳞状细胞癌中上调，但在腺癌中没有上调。此外，电离辐射 (IR) 和其他 DNA 损伤试剂，ANRIL 表达大大增加。这些数据表明，增加的 ANRIL 表达赋予肺癌细胞对电离辐射的抵抗力。

然后，该研究探索了 ANRIL 是否在 DNA 损伤修复中发挥了关键作用。在辐照后的 ANRIL-KD 细胞中，在 8 h 时观察到的 DNA 损伤比在 NC 细胞中更多。相比之下，辐照后在 ANRIL-OE H460 细胞中观察到较少的 DNA 损伤。这些结果表明 ANRIL 的缺失导致 IR 后未修复的 DNA 损伤。在了解了 ANRIL 在 DNA 损伤修复过程中的必要性后，本研究继续进一步研究了 ANRIL 在 DNA 损伤反应 (DDR) 中的确切功能。结果表明 ANRIL 是 DDR 和增加肺癌细胞抗癌性所必需的。

为了探索 ANRIL 对体内抗癌性的影响，将 NC 和 ANRIL 敲低的 H1299 细胞以及过表达载体和 ANRIL 的 H460 细胞皮下注射到裸鼠中。ANRIL 敲低结合局部照射导致肿瘤体积曲线和重量方面的肿瘤生长减少。一致地，与载体组相比，ANRIL-OE H460 细胞显示出肿瘤对放疗的抵抗力增加。这些体内实验结果证实了 ANRIL 在放疗抵抗中的作用。

ANRIL 缺陷细胞中 ATR 和 HR 修复的失活促使研究这些影响的潜在机制。通过 RNA FISH 测定发现 ANRIL 位于细胞核中，这表明它可能在直接调节 DNA 损伤修复中发挥作用。为了确定 ANRIL 在 HR 修复过程中是否与其直接靶标相互作用，通过使用 ATR-、RAD51- 和 RPA2 特异性抗体进行了 RIP 实验。令人惊讶的是，ANRIL 富含 ATR 特异性抗体而不是 RPA2 或 RAD51 抗体免疫沉淀的蛋白质-RNA 复合物，表明 ANRIL 可能在调节 ATR 功能中发挥作用。进一步的研究表明，ATR 与 ANRIL 的结合不依赖于其磷酸化水平。此外，ANRIL 与 ATR 蛋白的直接结合通过 RNA pulldown 测定得到证实。lncRNA最重要的功能之一是与蛋白质结合，从而导致功能改变；此外，尚未报道任何与 ATR 结合的 lncRNA。

为了确定与 ATR 相互作用的 ANRIL 的详细序列，基于使用 RNA 折叠软件预测的二级结构生成了 ANRIL 功能区的不同片段。通过 RNA pulldown 测定，5'-区域（0-880 bp 和 881-1640 bp）被鉴定为与 ATR 蛋白结合所必需的。这些结果表明 ANRIL 在 N 端直接与 ATR 结合。

作为 DDR 中的关键激酶，ATR 可能解释了 ANRIL 在 DNA 损伤修复中发挥的关键作用。该研究通过在 ANRIL-KD 细胞中过表达 ATR 进行拯救实验，并在 ANRIL-OE 细胞中进行 ATR 敲低来改变 ATR 的表达。数据显示，ANRIL-KD 细胞中的 ATR 过表达显著提高了 DNA 修复和细胞存活的功效。然而，ANRIL-OE 细胞中的 ATR 敲低抑制了 DNA 修复和细胞存活。这些结果表明 ANRIL 直接结合并保护 ATR 免受泛素化介导的降解，然后，ANRIL 促进 HR 修复和抗癌。

总之，靶向 ANRIL 会导致 ATR 降解，这将进一步导致 HR 修复缺陷。因此，这些发现可以为实现新机制和获得潜在的治疗应用提供线索，不仅适用于放疗，也适用于与 ATR 相关 HR 修复相关的化疗。

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PDCD10/CCM3基因编码的支架蛋白在大多数组织中普遍表达，研究发现CCM3蛋白参与调节上皮细胞和内皮细胞的肌动球蛋白收缩，那么CCM3是否也有助于CAF诱导的ECM重构呢？本文研究人员首先从头颈癌、外阴癌和宫颈癌患者中分离得到CAF（分别为HN-CAF、V-CAF、Cer-CAF），用siRNA敲低CCM3，并在由I型胶原和基质胶混合而成的致密三维凝胶中培养，结果显示CCM3的缺失显著增加了三种CAF细胞株的凝胶收缩，CAF激活增强，伴随着更强烈的收缩机制。同时，通过在密集的垂直纳米线阵列上电镀细胞，并测量细胞在纳米线上移动时纳米线尖端的位移，获得对CAF施加牵引力的能力的测量，结合单细胞分析，研究人员发现CCM3的缺失显著增加了V-CAF施加的牵引力。而CCM3的缺失显著诱导了三种人CAF中的YAP/TAZ核转运，使之激活。这些发现表明，CCM3可以调节人CAF中向ECM传递的内在力，并且是YAP/TAZ激活的负调控因子。

进一步实验结果显示，CCM3对YAP/TAZ的调控不依赖于Hippo激酶、STRIPAK（CCM3是STRIPAK复合物的一个组成部分，该复合物被证明可调节Hippo激酶的活性）和CCM复合物，于是，研究人员开始将注意力转向非典型的机械转导途径。利用不同抑制剂阻碍肌动球蛋白骨架可以完全挽救由CCM3缺失造成的YAP/TAZ核定位及CAF诱导的凝胶收缩，由此表明CCM3的缺失是通过刺激肌动球蛋白细胞骨架的收缩性来激活YAP/TAZ的。同时，研究发现CAF中的CCM3是内在细胞骨架张力的负调控因子。

肌动球蛋白细胞骨架内产生的张力可以通过黏着斑传递，从而诱导整合素介导的周围基质重构。本文研究结果显示，CCM3的缺失可以导致FAK/Src/phospho-paxillin通路的激活上调，从而改变黏着斑的大小和生长速率。而结合CCM3缺失后牵引力的增加，研究人员指出CCM3可能可减弱由内而外的信号传导，并缓冲肌动球蛋白网络、黏着斑和ECM之间的耦合。进一步地实验发现，细胞质中的CCM3定位于黏着斑，TAP/TAZ的激活与黏着斑中的CCM3的水平呈负相关，并且CCM3在黏着斑中以相互排斥的方式与FAK竞争性结合桩蛋白（paxillin，一种涉及胞外基质细胞黏附（黏着斑）位点上肌动蛋白-膜附着的细胞骨架蛋白），像“守门员”一样调节着FAK/Src的激活和机械转导。

最后，本文研究人员从两方面阐明了CCM3负调控TAP/TAZ信号的重要作用。间充质基质/干细胞（MSC）的分化命运受到环境弹性特征和YAP/TAZ激活状态的强烈影响，其在软环境中倾向于向脂肪细胞分化，而在坚硬基质中更易于向成骨细胞分化。本研究发现，CCM3的缺失可以显著增强MSC向成骨细胞的分化，尤其在软基质中的分化，抑制MSC向脂肪细胞的分化，并且是FAK依赖性的，由此表明CCM3介导的YAP/TAZ调控可直接影响干细胞的命运和分化。此外，小鼠体内成瘤实验发现，虽然成纤维细胞群中CCM3的缺失没有影响肿瘤的生长，但是肿瘤微环境经历了明显重塑，纤维胶原水平增加，成纤维细胞激活，肿瘤转移负担增强。由此表明CCM3是CAF诱导的体内生物力学的调节因子，CCM3的不稳定会产生不利的肿瘤微环境和转移扩散影响。

综上所述，本研究证实CCM3是正常成纤维细胞、CAF和MSC中YAP/TAZ信号的机械调节因子，作为机械转导的“守门员”，在黏着斑上与FAK竞争性结合桩蛋白，减弱FAK的激活和YAP/TAZ信号，影响肿瘤的进展和干细胞分化，从而为癌症和再生医学提供了新的潜在靶点。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41556-021-00702-0

SpaceM 方法原理

为了使单细胞代谢组学分析大众化，作者利用商品化的MALDI成像质谱和光学显微镜开发了一种开源方法，SpaceM。基于MALDI的单细胞代谢组学分析的难点是将代谢产物强度的分配给单个细胞。为了解决这一问题，作者利用光学显微镜进行图像分割和校准，然后MALDI成像分析代谢物。

对于SpaceM，细胞需要在显微镜兼容的基质上培养，然后固定、荧光染色和干燥。SpaceM从获取显微图像开始，称为pre-MALDI。pre-MALDI图像为细胞细分提供了广泛的表型信息，包括单个细胞的荧光强度和形态学特性。接着，用MALDI基质喷洒样品，MALDI成像质谱对样品进行非目标分析，检测其中代谢物和脂质。MALDI采样后会有明显的烧蚀痕迹，可以用于确定产生信号的区域。因此，进行第二轮显微成像(post-MALDI)与第一轮共校准，并利用新开发的高精度图像校准方法，实现亚微米精度的分辨率。最终，SpaceM提供了一个单细胞空间分子矩阵，并为每个细胞提供了在其固有的空间环境中量化的多重信号，包括非目标代谢谱、荧光强度和空间形态特征。

通过预测单细胞分辨率的细胞类型来验证SpaceM

为了验证SpaceM的有效性，作者仅基于单细胞代谢图谱，预测了共培养的人HeLa细胞和小鼠NIH3T3成纤维细胞的细胞类型。为了验证预测的准确性，细胞类型利用mCherry和GFP强度之间的线性边界确定（两种细胞分别持续表达H2B-mCherry和GFP)。SpaceM提供了445个HeLa和400个NIH3T3共培养细胞的88种代谢物的代谢图谱，基于单细胞代谢谱的鉴定精确度达到91%。

除了表征细胞类型外，作者还使用SpaceM来识别脂肪酸刺激下分化的人肝细胞(dHepaRG)细胞系的代谢状态。该细胞模型常用于NAFLD（非酒精性脂肪肝）研究，其中肝细胞经历脂质代谢重塑和细胞内脂肪滴的积累，称为脂肪变性。进一步，NAFLD可进展为NASH（非酒精性肝炎），肝脏中的脂肪会引起炎症，即肝炎和肝细胞损伤。随着时间的推移，这会导致肝纤维化或瘢痕，肝硬化和肝癌。SpaceM提供了来自2840个dHepaRG细胞的740个代谢物的谱图。UMAP和非监督聚类的代谢谱显示了两个不同的亚群的特征【1,2】。

炎症环境中脂质刺激肝细胞代谢状态的表征

肝细胞中的脂质组成在稳态条件下受到严格调控。然而，过量的游离脂肪酸和其他应激源，包括炎症细胞因子，会促进异常的脂质储存，最终导致NASH。为了研究NAFLD向NASH转变过程中单个肝细胞的代谢重构情况，作者分析了四种情况下的细胞:

(1)CTRL：不做处理的控制组，模拟稳态状态的;

(2)+FA：以油酸和棕榈酸为刺激剂，模拟无炎症的NAFLD；

(3)+FA+IL17A：以FA和炎性细胞因子IL17A为刺激剂，模拟NASH；

(4)+FA+IL17A+TPCA1：以FA，IL17A及抑制其炎症作用的TPCA1为刺激剂。

SpaceM提供了来自29,738个肝细胞的740个代谢物的谱图，非监督聚类显示了三个主要聚类，分别代表稳态、过渡态和脂肪代谢状态。伪时间分辨的单细胞代谢谱图可以用于表征肝细胞从稳态到脂肪态的发展。代谢状态标记物随着时间逐渐变化，表明各状态内的代谢均存在异质性。作者还鉴定到了不同状态的特定代谢标志物，并用LC-MS/MS进一步验证。

与先前的方法相比，SpaceM有几个优点：首先，SpaceM可以使用任何现代的MALDI成像源，而不需要特殊的仪器。第二，SpaceM允许细胞在其原生培养环境中进行分析，从而避免任何扰动，并提供形态特征和细胞与细胞之间的关系。第三，提供亚细胞精度的分辨率。

总之，开源的SpaceM方法不仅填补了蓬勃发展的单细胞代谢组学领域的巨大空白，而且被用于表征dHepaRG肝细胞的代谢异质性和状态。SpaceM简单的设计、低的仪器要求和良好的兼容性可能会为单细胞代谢组学的平民化铺平道路。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41592-021-01198-0

参考文献：

【1】 Tanner, N. et al. Regulation of drug metabolism by the interplay of inflammatory signaling, steatosis, and xeno-sensing receptors in HepaRG cells. Drug Metab. Dispos. 46, 326–335 (2018).

GC通过靶向多种组织如脂肪和肝脏中的糖皮质激素受体 (GR) 发挥作用。过量的GC会导致库欣综合征 (Cushing’s syndrome) ，主要表现为中心性肥胖，并伴有高血糖、血脂异常和肝脂肪变性。GC对脂肪组织中的脂质代谢有着复杂的调控，其促进甘油和脂肪酸的产生，为肝脏糖异生提供底物和能量。GC 还通过与其他因素如胰岛素协同作用直接调节脂肪生成基因的表达。在肝脏组织中中，GC 则激活GR结合到糖异生关键基因 PCK1 和 G6PC 的启动子区域，增加肝脏葡萄糖的产生，导致接受GC治疗的个体患糖尿病。GC 还增加胰岛素刺激的脂肪生成并减少肝脏中的脂肪分解，导致库欣病患者和接受外源性GC 治疗的患者中发生高甘油三酯血症和肝脂肪变性的现象。基于GC在脂肪和肝脏组织中的重要作用，在这项研究中，研究人员构建了两套具有不同遗传背景来源的脂肪细胞和肝细胞平台来研究GC药物的个体特异性反应。分别为肥胖病人来源的脂肪干细胞分化的脂肪细胞，及人诱导多能干细胞分化的肝细胞。

研究人员进而检测不同病人来源的脂肪细胞和肝细胞是否对GC药物地塞米松（Dexamethasone）反应不同。通过转录组学分析，作者发现不同个体来源的脂肪细胞和肝细胞呈现出个体特异性的药物反应。进一步的研究发现，GR在基因组的结合也呈现出一定的个体特异性。通过生信分析，作者发现这些个体特异性的GC药物反应是由个体特异的GR在基因组上的结合驱动的。同时非常有意思的是，脂肪细胞和肝细胞也展示出细胞类型特异的GC药物反应，这和GR在脂肪细胞和肝细胞的细胞类型特异的基因组结合是相一致的。De novo motif分析揭示细胞谱系决定因子如NF1、HNF4可能介导细胞类型特异的GR激活。

作者进一步发现数百个SNPs可以通过影响GR或它的辅助转录因子的结合域 (motif) 来调控GR在基因组上的结合，从而影响GC的药物反应。这些SNPs富集在多种代谢性状 (metabolic traits) 如BMI、胆固醇、糖尿病和甘油三酯等。同时，研究人员注意到只有部分的个体特异的GR结合位点内含有影响GR基因组结合的SNPs。为了探讨其它影响个体特异GR功能的因素，研究人员进行了ATAC-seq和ChIA-PET实验。他们揭示部分SNPs可以通过影响较远位置的转录因子的结合从而调节GR在基因组上的结合；而另外一部分SNPs是则通过影响染色质的空间结构来调控GR的功能。

研究人员通过一系列的细胞与分子实验验证了SNPs调节GR功能的活性。最后他们检测这些发现是否可以预测病人使用GC药物后的代谢相关副作用。在St. Jude儿童医院的400个临床上使用GC药物的急性淋巴细胞白血病儿童病人中，及宾夕法尼亚大学biobank中，他们发现rs10980797、rs2060982可以预测病人服用GC药物后出现高血糖的风险；rs10881935和病人出现高血脂的现象紧密相关；rs55830753和病人胆固醇水平高低有关；rs13038139可以预测病人服用GC药物后BMI指数的高低；但这些SNPs不影响GC药物对病人相关病征的疗效。

综上，作者对不同个体来源的脂肪细胞和肝细胞的研究揭示了细胞类型特异性和个体特异性的 GC 反应，为识别具有严重药物不良反应的人群奠定了基础。更为重要的是，研究人员专注于研究靶向特定转录因子的药物以及和药物不良反应密切相关的细胞类型，这些“有偏见”的研究方法大大提高了发现风险等位基因的概率。这些研究思路为使用 GC 药物治疗癌症和免疫疾病的个性化和精确医疗提供了前进方向。

生物岛实验室胡文祥博士为第一作者和共同通讯作者，宾夕法尼亚大学江纯阶博士为共同第一作者，Mitchell Lazar院士为本论文的通讯作者。工作得到了宾夕法尼亚大学Mitchell Lazar实验室其他成员、Daniel Rader团队及St. Jude儿童医院Mary Relling团队的大力支持。

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