DNA甲基化是一种进化保守的表观遗传修饰，在沉默转座因子和调节基因表达中起关键作用。在拟南芥中，DNA甲基化发生在三个序列环境中：CG，CHG和CHH（其中H代表A，T或C）。植物中DNA甲基化的建立涉及DNA甲基转移酶DRM2，通过植物特有的RNA介导的DNA甲基化（RdDM）途径进行。 

RdDM涉及通过RNA聚合酶IV（Pol IV）转录30-40个核苷酸（nt）单链RNA（P4RNA），然后被依赖于RNA的RNA聚合酶2（RDR2）逆转录。通过DICER-LIKE 3（DCL3）处理成24 nt小干扰RNA（siRNA），并加载到ARGONAUTE 4（AGO4）。接下来，与siRNA结合的AGO4通过序列互补识别由Pol V转录的非编码P5RNA，这触发DRM2的募集和从头甲基化。建立后，维持CG甲基化需要DNA甲基转移酶METHYLTRANSFERASE 1（MET1），而维持CHG和CHH甲基化则需要染色体甲基化酶3（CMT3），CMT2和DRM2。

对称的CG甲基化在不同生物之间是保守的，并且大部分分布在异染色质区或基因区。在植物中，异染色质区域上的甲基化发生在CG，CHG和CHH环境中，并且在转座因子和重复序列的转录沉默中起重要作用。相比之下，在基因区域的甲基化，称为基因体甲基化（gbM），与基因表达成正相关，并在组成型表达的基因中富集。尽管gbM在各种生物中具有高度的保守性，但其功能尚不为人所知。

在不同生物中的研究提出了gbM的各种功能，包括调节基因表达，选择性剪接，反义转录，通过外显子定义提高剪接准确性，抑制RNA聚合酶II（Pol II）起始以及降低Pol II延伸效率。然而，在gbM水平存在差异的不同植物物种和模型植物拟南芥中进行的大多数研究表明，这种修饰对基因表达的作用有限。同样，gbM似乎并不影响植物中不同组蛋白修饰的整体模式。组蛋白变体H2A.Z是一个例外，其中已假设gbM可以防止H2A.Z扩展成基因体和异常转录本的转录。

随着DNA靶向工具（例如人造锌指（ZF），TAL效应子和CRISPR / Cas9系统）的发展，已成功在动植物中实现了对特定基因组位点的DNA甲基化的控制操作。最近在拟南芥中的研究表明，靶向由人工ZF蛋白融合不同RdDM组分足以将甲基化靶向基因组中的ZF结合位点。先前在不同生物中的研究都使用了Spiroplasma sp.菌株MQ1 CG甲基转移酶M.SssI（SssI）靶向甲基化。

在这项工作中，将SssI融合到旨在靶向FAGEERING WAGENINGEN（FWA）启动子的人工ZF（ZF-SssI）上，并测试其靶向拟南芥中甲基化的能力。ZF-SssI融合蛋白成功地将可遗传的DNA甲基化靶向FWA启动子和其他ZF脱靶位点。此外，ZF-SssI植物表现出全基因组范围的异位CG甲基化，尤其是在外显子和转录终止位点（TTS）上方，这表明ZF-SssI融合体具有非特异性异位活性。重要的是，在大多数基因组区域中，异位CG甲基化高度可遗传。该研究利用这个系统来表征由ZF-SssI异位甲基化的基因座，以及CG甲基化对基因表达，组蛋白修饰和组蛋白变体的影响。 

原文检索：Ectopic targeting of CG DNA methylation in Arabidopsis with the bacterial SssI methyltransferase

该研究工作基于他们之前开发的一种糖基化组学的鉴定方法。简而言之，通过给前体糖基标记上一个叠氮基团（例如本研究用到的AC4ManNAz），一旦它们被整合到细胞内的糖蛋白(也包括脂类) 组之后就可以与biotin探针交联，从而被富集以及进行后续的鉴定分析。借助这样一个系统，作者在被标记的细胞中富集到了高纯度的RNA样品，这说明RNA上可能也存在糖基化。但在此之前，还没有人将糖基化与RNA联系在一起，于是作者由此展开了探究。

作者首先利用RNA印记实验证实AC4ManNAz处理可以浓度梯度和时间梯度的升高细胞内glycoRNA的水平，并排除了体系中DNA与蛋白质的干扰。此外，他们在AC4ManNAz处理的小鼠肝脏和脾脏组织中也同样检测到了被标记的RNA。这些实验结果表明glycoRNA无论是在体外培养的细胞系还是动物体内都是广泛存在的。

在此基础上，作者尝试去回答围绕glycoRNA的两个核心问题。第一，细胞中哪些RNA上存在糖基化修饰？第二，glycoRNA上糖基的结构是什么？通过蔗糖梯度离心实验，作者发现这些糖基化的RNA主要是小RNA (<200nt)。而更进一步的研究结果显示glycoRNA主要存在于Y RNA中（一类小细胞核RNA）。接下来，借助多孔石墨化碳柱液质分析系统 (PGC-LC-MS)，作者在RNA样品中共鉴定到107个潜在的糖基化前体分子，有意思的是，与蛋白质的糖基化不同，这些修饰在RNA上的聚糖主要是一些小分子的基团，且种类更加集中。例如，在293T和H9细胞的glycoRNA中富集到大量的岩藻糖, 而在HeLa细胞的glycoRNA则包含大量的唾液酸修饰。此外，作者发现glycoRNA的产生依赖于经典的蛋白质N-糖基化的代谢途径。

最后，作者试图去寻找这些glycoRNA潜在的生理功能。首先，作者发现这些glycoRNA主要富集在活细胞的细胞膜外部，由此作者推测这些定位于细胞表面的glycoRNA可能会与细胞膜上的糖蛋白和糖脂具有类似的功能，例如参与细胞之间的交流，连接等等。进一步的研究则表明，这些细胞膜上的glycoRNA 不仅可以被RNA抗体所特异性识别，还可以与同样定位在细胞膜上的唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素受体 (Siglec receptor) 结合，这说明除了糖蛋白和糖脂，GlycoRNAs也可以充当Siglec 受体的直接配体，并在免疫调控中发挥重要的生理功能。

总的来说，该研究团队的发现具有十分重大的科学意义：首先，他们揭示RNA也可以作为糖基化的载体，并且证实了glycoRNA在体内是广泛存在的，首次将糖生物学与RNA联系在一起，开辟了一个新的研究领域。其次，他们的研究发现GlycoRNA可以充当细胞膜Siglec 受体的直接配体。考虑到Siglec 受体在免疫调控中的重要功能，这意味着GlycoRNA在宿主免疫防御、肿瘤免疫逃逸、自身免疫性疾病等生理和病理过程中可能发挥重要作用，而这项研究则推开了这一研究领域的大门。

原文检索：Small RNAs are modified with N-glycans and displayed on the surface of living cells

结果指出，共有 TCR克隆的平均频率可反映肿瘤在免疫治疗作用下的应答潜能，更有可能预示PD-1/PD-L1抑制剂治疗中获得疗效及生存获益。研究者推测TIR index对疗效的预测作用是基于其包含了肿瘤特异性T细胞。为了验证该假设，该研究将预测出的潜在肿瘤新抗原序列在体外进行新抗原肽段合成。随后将合成的肽段在体外刺激患者外周血来源的T细胞与DC细胞，找出并构建了可活化T细胞的新抗原肽段- HLA四聚体，通过该四聚体获取新抗原特异性T细胞亚群并进行TCR测序，结果发现基线时的TIR index包含新抗原特异性T细胞。因此，TIR index可反映肿瘤微环境中新抗原特异性T细胞的水平。

免疫微环境特征在肿瘤与免疫治疗的相互作用中起重要作用。该研究发现炎性因子释放水平、微环境中抗原呈递功能及免疫杀伤潜力均在TIR index高的患者中呈现优势。进一步对患者治疗过程中的外周血ctDNA及PD-1+CD8+ TCR进行了动态监测，结果显示共有克隆频率的变化可能反映了存在于外周血的肿瘤特异性T细胞的活化，扩增及转运过程。佐证了TIR index在免疫治疗中应用价值，为免疫应答的机制提供了新的探索视角。

肿瘤特异性T细胞是近年来的研究重点之一，并可作为未来肿瘤新抗原疫苗及TCR- T治疗技术的基础。由于体外验证实验较为复杂，筛选功能性T细胞存在较高的技术门槛并难以用于临床实践。王洁/王志杰教授团队通过系列免疫组库分析及功能验证研究证实外周血PD-1+CD8+TCR可作为一种无创的方式来评估免疫应答的潜力，基于肿瘤浸润淋巴细胞与外周血PD-1+CD8+TCR的新型免疫应答指数TIR index可反映肿瘤特异性T细胞水平及其伴随的免疫微环境特征。据悉，该团队正在进行肿瘤抗原生成-呈递-识别的整合性分析，有望为免疫治疗优势人群的筛选提供新的思路。研究团队长期致力于肺癌分子分型及无创检测的转化研究，该系列研究进一步丰富了研究团队建立的肺癌无创分型体系，实现了无创分型向精细化免疫治疗的转化。

原文检索：Weighting tumor-specific TCR repertoires as a classifier to stratify the immunotherapy delivery in non–small cell lung cancers TCR

在小鼠中，SSC潜能主要局限于一小部分未分化精原细胞（Aundiff），Aundiff在其形态、基因表达和体内行为中显示出异质性组成。为了确定在移植后恢复精子发生的SSC的身份并确定其在再繁殖期间的动态，作者首先对成年小鼠的宿主睾丸中的供体Aundiff进行了定量克隆命运分析（见图1），尽管发现GFRα1+和Ngn3+这两种细胞能在宿主精小管中定居，但绝大多数产生的克隆会随之消失（移植后第一周）。由于SSC需要一个多月的时间才能完全分化并离开小管，因此这些克隆消失一定与细胞死亡相关。对移植后供体细胞组分变化的量化结果显示，从Ngn3+状态转化的GFRα1+细胞在移植后作为真正的GFRα1+细胞发挥作用。在这里，我们需要提前了解，Aundiff的GFRα1+部分构成了自我更新池的大部分，同时产生了分化启动的Ngn3+；而Ngn3+细胞很少自我更新，而是以依赖于维甲酸（RA）信号的方式分化为Kit+精原细胞，部分有可能可逆地过渡到GFRα1+状态，在组织损伤后的恢复中起着至关重要的作用（见图1）。

为了进一步阐明移植精原细胞的不同命运行为，作者进一步在宿主睾丸中进行活体成像分析，观察到在移植后供体精原细胞并未进行完全分裂，而是在分离和合胞状态之间不断转换，同时表现出频繁的细胞死亡。随后作者基于先前研究建立的可以定量捕获克隆命运行为的模型，并基于活体成像的不完全分裂率测量值，调整四个拟合参数（合胞体分裂和细胞丢失的有效率、GFRα1+细胞室发生细胞丢失的时间以及GFRα1-细胞的有效增殖率）后，根据优化模型得出的结论，作者认为在初始活跃阶段阻断供体细胞的分化可能会扩大SSC细胞群规模，从而导致长期持续生存的可能性增加。

Ngn3+向Kit+分化精原细胞的分化是一个由RA信号驱动的过程（见图1A），于是作者使用睾丸RA合成有效化学抑制剂Win18446（WIN）来证明上述猜想。有趣的是，作者发现WIN有效地阻止了Aundiff的分化，同时也观察到GFRα1+细胞的增加，表明GFRα1–细胞向GFRα1+状态的反向转化增强。更为重要的是，WIN处理介导的未分化细胞池的扩大有效地提高了每个克隆长期存活的可能性，进一步支持克隆在获得GFRα1+细胞后变得稳定的结论。

最后，作者评估了在移植后经WIN处理对宿主生育能力的影响。作者使用UBI-EGFP小鼠作为供体，与上述观察一致，WIN处理的宿主中长期重新繁殖的克隆数量大量增加。12只接受WIN治疗的宿主中有5只通过与正常雌性小鼠自然交配获得正常产仔数的供体细胞衍生（GFP+）后代。相反，DMSO处理的对照组没有产生后代。此外，来自WIN处理的宿主雄性的后代表现出正常的生长和生育能力。

总的来说，这项研究以单细胞分辨率分析了供体小鼠SSC的命运，证实了使用RA合成化学抑制剂暂时抑制供体SSC分化来恢复宿主及其后代生育能力的策略，揭示了精原细胞移植在从癌症患者的生育能力恢复到生物多样性保护的一系列潜在应用。

原文检索：Transient suppression of transplanted spermatogonial stem cell differentiation restores fertility in mice 

为了回答METTL16甲基转移酶结构的功能的问题，研究者利用线虫中METTL16的同源蛋白METT-10开展实验，因为METT-10不含VCR结构（图1）。通过在m6A-IP-seq，研究者在线虫中鉴定到了176个m6A位点（线虫不具有METTL3-METTL14复合体，所以m6A水平较低）。通过对比敲除METT-10后m6A的变化，研究者进一步确定了METT-10也调控U6和SAM合成酶SAMS-3,SAMS-4,SAMS-5的m6A水平，这与METTL16在哺乳动物中的功能一致。然而，METTL16介导SAM合成酶3’UTR的m6A修饰，而METT-10催化的m6A却是在SAM合成酶的2号内含子的3’剪接位点AG上。

由此，研究者推测，METT-10催化的m6A可能与可变剪接相关。确实，通过in vivo和in vitro实验，研究者发现当3’剪接位点AG携带m6A修饰时，U2剪接辅助因子U2AF35无法正确识别这一位点，造成内含子的异常滞留。

以上实验都是将线虫培养在营养丰富的饮食条件下得到的，研究者意外的发现，当给予低营养条件时，METT-10调控SAM合成酶异常剪接的现象消失了。这提示了一种SAM的负反馈调节：即高营养时，细胞内SAM较丰富，METT-10通过介导SAM合成酶3’剪接位点的m6A修饰，抑制其正常的剪接，从而降低SAM的含量；而在低营养条件下，METT-10则不影响AM合成酶的剪接，从而保证SAM的产生（图2）。但是尚不清楚METT-10如何响应营养变化。

图2 不同营养条件下METT-10的功能

值得注意的是，线虫和哺乳动物在低SAM情况下对SAM的调节不同。面对SAM的缺乏，线虫是保证SAM合成酶的正常合成，一种听之任之一切随缘的态度；而哺乳动物却急不可耐的通过METTL16的VCR结构促进SAM合成酶的剪接，显示出对SAM含量的更高需求（图3）。这可能与哺乳动物的胚胎发育更依赖SAM有关，也因此，在小鼠中敲除METTL16会造成胚胎死亡，而线虫在缺失METT-10后仍能存活。

虽然哺乳动物的METTL16通过3’剪接位点调控SAM合成酶的剪接，但是研究者确实通过测序分析找到了一批在小鼠细胞中受METTL16调控的3’剪接位点，说明METTL16通过介导3’剪接位点AG的m6A甲基化，从而调控剪接的机制是保守的。但是对于小鼠和人中METTL16的靶基因还需更多的in vivo实验验证。

总的来说，该研究揭示了METTL16介导的m6A甲基化在可变剪接中的重要功能，并发现线虫利用这一机制响应饮食的变化和SAM稳态。有趣的是，除了本研究提到的m6A调控SAM稳态，SAM也可以调控m6A水平：在饮食中限制甲硫氨酸的摄入能降低METTL3介导的m6A，并有望成为多囊肾病的新的治疗思路。

原文检索：Splice site m6A methylation prevents binding of U2AF35 to inhibit RNA splicing

胆碱激酶α2（Choline Kinase α, CHKα2）的经典功能是参与卵磷脂合成的第一步，将胆碱（choline）磷酸化为磷酸胆碱（phospho-choline）用于细胞的膜结构的形成。该项研究发现了CHKα2 的全新功能，即在能量不足时，诱发脂滴降解。

肿瘤细胞能量缺乏时，被AMPK磷酸化和KAT5乙酰化的CHKα2能由细胞浆转位到脂滴表面，同时发挥了蛋白激酶功能，磷酸化脂滴表面蛋白PLIN2/3，从而促进PLIN2/3被分子伴侣HSC70识别，使得PLIN2/3通过自噬途径被降解。失去PLIN2/3蛋白包被的脂滴暴露出内部的脂类分子，被脂类水解酶和自噬体降解，从而促进肿瘤发生发展。

本研究报道了一条新型的细胞响应能量应激，调控脂类代谢的信号路径，并阐释了CHKα2的代谢激酶与蛋白质激酶功能转换的分子机制。该研究不仅为癌症的个体化治疗揭示了新的代谢标记物和分子靶点，而且对靶向肿瘤脂代谢的药物研发具有重要的指导意义。

肿瘤的大量基因突变及特有的微环境，往往导致代谢酶原有的功能改变并赋予其新的非代谢酶功能。该研究是吕志民团队继发现糖代谢酶PKM2 （Cell，2012, PMID: 22901803; Molecular Cell, 2014, PMID: 24316223）、PGK1（Molecular Cell，2016, 2017, 2019, PMID: 26942675 , 28238651, 31492635）、KHK-A（Nature Cell Biology, 2016, PMID:2708854; Science Advances, 2019, PMID: 31032410）、PCK1（Nature, 2020, PMID: 32322062）的蛋白激酶活性在肿瘤发生中扮演重要作用之后，发现的第五个具有蛋白激酶活性的代谢酶。这些研究，改变了业界对肿瘤代谢的传统认知，为肿瘤代谢领域的研究做出了突出贡献。

原文检索：Choline Kinase Alpha 2 Acts as a Protein Kinase to Promote Lipolysis of Lipid Droplets 

根据预测，实验证实突变通过影响多个自噬相关蛋白如ATG4B、STBD1、EHMT2和BRAF的LIR基序改变自噬的选择性。泛癌分析表明糖原自噬受体STBD1可能具有潜在的抑癌功能，结肠癌临床样本的免疫组化结果也发现STBD1在癌症组织中表达下调。进一步研究表明STBD1的W203C突变通过破坏其LIR基序，削弱STBD1与LC3家族成员GABARAPL1和糖原的细胞共定位，并抑制胞内的糖原自噬和代谢过程。细胞增殖和小鼠移植瘤实验表明，过表达STBD1显著抑制癌细胞生长，而过表达突变体STBD1 W203C或敲低STBD1则促进肿瘤增殖。转录组测序分析表明，敲减或W203C突变导致癌症细胞的代谢重编程，结合靶向代谢组和代谢流分析发现敲减STBD1促进肿瘤细胞的糖酵解（Glycolysis），增强三羧酸循环与核酸代谢，从而促进肿瘤增殖。最后，根据iCAL预测的148个蛋白质，模拟了联接自噬选择性和肿瘤发生的分子网络，推测突变可通过影响9种自噬相关通路参与调控癌症。

本工作通过系统预测改变LIR基序的相关突变，揭示了癌症突变影响自噬选择性的作用机制，发现W203C通过改变STBD1的LIR基序，抑制糖原自噬和代谢过程从而促进肿瘤生长，首次阐明了糖原自噬参与癌症调控的分子机制，并为相关靶向癌症的自噬选择性调控研究和临床实践提供了新的计算方法和参考数据。

原文检索：Model-based analysis uncovers mutations altering autophagy selectivity in human cancer

恶性肿瘤侵袭依赖于转录因子Zeb1驱动的上皮间质转化（EMT），且EMT的发生与免疫治疗耐药相关，这提示侵袭前沿的癌细胞是免疫治疗的靶标，但尚未有研究去证实，也不清楚侵袭前沿EMT的发生是否与TAMs的M2替代极化有关。鉴于上述原因，此研究在K-Ras驱动的肺腺癌（AC）追踪了Zeb1与免疫检查点和肿瘤微环境中免疫细胞浸润的关系，尤其是对比分析了K-Ras突变合并Zeb1单基因缺失形成的肺腺瘤小鼠模型中的免疫检查点表达和免疫细胞浸润情况。结果表明Zeb1的表达诱导EMT发生的同时，在侵袭前沿诱导肿瘤细胞高表达免疫检查点CD47、PDL1，经CHIP实验表明Zeb1基因与PDL1和CD47均存在相互结合的序列基础，证实了Zeb1靶向调控PDL1、CD47的表达（图1）。

综上，此研究结果强调了侵袭前沿的癌细胞可能是免疫检查点治疗的靶标， Zeb1诱导的免疫检查点PDL1和CD47，其在侵袭前沿的表达可能预测患者对免疫治疗的反应，为PD1/PDL1耐药患者寻找替代或联合治疗靶点提供理论依据。

原文检索：Zeb1 induces immune checkpoints to form an immunosuppressive envelope around invading cancer cells

生物素依赖的临近标记方法可以用来对细胞中的蛋白质所占据的细胞内环境进行描述。例如BioID技术，使用的是生物素连接酶BirA*（*表示突变型）其中包含一个R118G的位点突变，可以作为“诱饵”与目的蛋白相融合，表达在培养的细胞或者是多细胞体系之中。生物素化的蛋白质随后可以被链霉亲和蛋白捕获，并通过质谱鉴定对相互作用的蛋白进行分析。由于球状蛋白平均直径是5-10nm，该技术的标记半径可以直接对相互作用蛋白进行生物素标记。目前，BioID技术已成功地用于定义许多不同的蛋白质复合物的组成、膜结合和无膜细胞器的空间组织的鉴定。

为了进一步对人活细胞中的相互作用蛋白质组进行进一步地鉴定，作者们使用BioID技术对32个不同的细胞组分中234个胞内蛋白标记作为“诱饵”钓取相互作用蛋白，用以建立人活细胞中的蛋白组织结构。每个诱饵蛋白会加上BirA*的标记，然后建立HEK细胞的稳定表达品系。通过对鉴定到相互作用蛋白与阴性对照的比较，作者们对钓取的相互作用因子的可靠性进行评价，其中一共有192个备选的蛋白标记物通过质量评估，共鉴定出了35,902个相互作用因子。

随后，作者们对不同的亚细胞定位得到蛋白质相互作用组的结果（图2）与先前大规模显微镜观察以及质谱研究的结果进行比对，对新的相互作用图谱的准确性进行评估。作者们发现与人类蛋白图谱（Human Protein Atlas，HPA）等已有图谱相比，新建立的不同亚细胞定位蛋白相互作用图谱精确地对蛋白相互作用组进行了预测。

线粒体和内质网之间的接触对于脂质和钙交换以及线粒体动力学是至关重要的。以线粒体以及内质网亚细胞定位的蛋白相互作用组为例，作者们对该相互作用图谱的准确性进行了进一步地鉴定。通过对线粒体过氧化物酶体以及内质网膜组分的交叉会话分析，作者们发现两个GTPases会调节线粒体与内质网的接触位点。BioID技术揭示出了更多富集在内质网膜上的组分，同时也揭示出了线粒体外膜以及内质网与线粒体接触位点上的蛋白质相互作用图谱。另外，BioID的技术也检测到了一些与线粒体融合相关的因子。这些结果表明，作者们建立的BioID数据库可以揭示不同亚细胞区室内和不同区室之间的新的蛋白质功能。

总的来说，该工作利用生物素化临近标记的方式建立了人细胞中不同亚细胞定位的蛋白质相互作用组，为进一步揭开人类细胞中蛋白质相互作用提供了更新的、更全面的见解，并且作者们建立了能够进行用户访问的网站humancellmap.org。在未来，人类细胞图谱需要更进一步的建立更高精度的、更密集诱饵蛋白的相互作用组，以及涵盖更多不同种类的人类细胞，进一步补充其他蛋白质组学和细胞生物学资源。

原文检索：A proximity-dependent biotinylation map of a human cell

为了评估 HBBS 碱基编辑的生理效应，该研究提供了 ABE8e-NRCH 并将 RNA 从人源化 SCD 小鼠导入 HSPC，然后将这些细胞移植到辐射小鼠中。十六周后，Makassar β-珠蛋白占血液中 79% 的 β-珠蛋白，缺氧引起的镰状细胞减少了三倍。与接受未编辑细胞的小鼠相比，接受碱基编辑的 HSPC 的小鼠显示出接近正常的血液学参数和减少的脾脏病理。编辑过的骨髓的二次移植证实了基因编辑在长期造血干细胞中是持久的，并表明 20% 或更多的 HBBS-to-HBBG 编辑足以进行表型拯救。人类 HSPC 的碱基编辑避免了在 Cas9 核酸酶处理后观察到的 p53 激活和更大的缺失。总之，这些发现表明 SCD 的一次性自体治疗可以消除致病性 HBBS，产生良性 HBBG，并最大限度地减少双链 DNA 断裂的不良后果。

另外，2021年2月19日，博德研究所刘如谦(David R.Liu)及哈佛医学院Dong Min共同通讯在Science 在线发表题为Phage-assisted evolution of botulinum neurotoxin proteases with reprogrammed specificity 的研究论文，该研究开发了具有同时阳性和阴性选择的噬菌体辅助蛋白酶进化系统，并将其应用于三种肉毒杆菌神经毒素（BoNT）轻链蛋白酶。该研究将BoNT / X蛋白酶进化为单独的变异体，这些变异体优先裂解囊泡相关膜蛋白4（VAMP4）和Ykt6，进化了BoNT / F蛋白酶以选择性裂解非天然底物VAMP7，并进化了BoNT / E蛋白酶以裂解磷酸酶和肌腱同源蛋白（PTEN），但不是神经元中的任何天然BoNT蛋白酶底物。进化的蛋白酶显示出特异性的大变化（218倍到 11,000,000倍），并且可以保留其形成自我递送至初级神经元的全毒素的能力。这些发现为重新编程蛋白酶建立了通用平台，以选择性地切割具有治疗意义的新靶标。

镰状细胞病是一种常染色体隐性遗传病，由 HBB 突变引起，通常编码成人 β-珠蛋白（βA）。在低氧浓度下，突变型 β-珠蛋白 (βS) 会导致红细胞 (RBC) 内的血红蛋白聚合，从而导致特征性的镰状红细胞以及一系列溶血、炎症和微血管闭塞。症状包括贫血、严重的急性和慢性疼痛、免疫缺陷、多器官衰竭和早逝。尽管同种异体造血干细胞 (HSC) 移植可以治愈 SCD，但通常无法获得最佳匹配的供体，并且该手术可能导致移植排斥或移植物抗宿主病。

自体 HSC 的体外修饰以规避 SCD 突变的有害影响是几种实验疗法的基础。已显示出早期临床前景的方法包括通过慢病毒载体异位表达抗镰状 β 样珠蛋白基因  和通过抑制或 Cas9 介导的 BCL11A 破坏诱导胎儿血红蛋白 (HbF)。然而，慢病毒载体存在插入突变的风险，并且可能无法有效抑制病理性βS 的表达。诱导 HbF 表达的基因操作不会消除 βS，并且当由双链 DNA 断裂 (DSB) 介导时，会带来与插入缺失、易位、大染色体片段丢失、染色体碎裂和p53 激活。Cas9 核酸酶介导的同源定向修复可以纠正 HBBS，但很难有效地重新填充 HSC并且还需要 DSB。通过将 HBBS 等位基因转化为良性变异而不引入 DSB 来消除 SCD可以克服这些限制。

腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 将活细胞中的目标 A•T 碱基对转化为 G•C，无需 DSB 或供体 DNA 模板，并且插入缺失的形成最少。在 SCD 中，编码 β-珠蛋白第6位氨基酸位置 GAG (Glu) 密码子突变为 GTG (Val)。虽然腺嘌呤碱基编辑不能恢复这种突变，但它可以将致病密码子转化为 GCG (Ala)，从而产生一种天然存在的非致病性变异，称为 Hb-Makassar (HBBG)。

该研究生成了一个 ABE (ABE8e-NRCH)，它将 SCD 等位基因转化为非致病性 HBBG Makassar 等位基因，在 SCD 患者的 CD34+ HSPC 中进行最少的非沉默旁观者编辑。经编辑的 HSPC 在植入小鼠后具有持久性，移植后 16 周的 HBBG 频率为 68%，并且衍生的红细胞中镰状细胞显著减少。

为了评估表型，该研究从 SCD小鼠模型中编辑了 HSPC，其中内源性 β-珠蛋白基因被人类 HBBS 取代，并将编辑后的 HSPC 移植到受辐射的成年受体小鼠中。编辑后的小鼠 HSPC 的初次和二次移植证实了长期 HSC 中的编辑，并将血液学参数恢复到接近正常水平。这些发现表明，HSC 的自体离体碱基编辑和移植是 SCD 的潜在一次性治疗方法。

原文检索：Base editing of haematopoietic stem cells rescues sickle cell disease in mice